Estudio de asociación del pangenoma en Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa y su relación con la colonización o infección en muestras clínicas

AUTORES

1. Alexander Tristancho-Baró. Médico. Hospital Ernest Lluch. Zaragoza. España.
2. Laura Eva Franco-Fobe. Farmacéutica. Hospital de Barbastro. Huesca. España.
3. Violeta Frutos Millán. Médico. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. España.
4. Natalia Burillo Navarrete. Médico. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. España.
5. Sara Sanz Sanz. Farmacéutica. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. España.
6. Olga Algara Robles. Farmacéutica. Hospital de Alcañiz. Teruel. España.

RESUMEN

La colonización por microorganismos multirresistentes en pacientes críticos o con patologías oncohematológicas es un factor de riesgo para el desarrollo de infección, con el consiguiente aumento en la estancia hospitalaria, costos al sistema sanitario y morbimortalidad. Klebsiella pneumoniae y Pseudomoas aeruginosa son particularmente relevantes a este respecto debido a su alta prevalencia como patógenos humanos, presencia de multirresistencia y factores de virulencia. Este trabajo evaluó la relación entre el pangenoma de cada una de estas dos especies, con su presencia como colonizantes o agentes de infección en muestras clínicas. Se empleó secuenciación de genoma completo. Los análisis bioinformáticos consistieron en control de calidad, ensamblado, anotación estructural y funcional, cálculo del pangenoma y estudio de asociación de genoma completo. Todas las muestras pasaron los controles de calidad necesarios. El análisis de pangenoma reveló un genoma accesorio del 65% y el 50% aproximadamente en K. pneumoniae y P. aeruginosa respectivamente. El gen flmA de K. pneumoniae se encontró en las cepas causantes de infección, respecto a las que solo eran colonizantes de forma estadísticamente significativa. De la misma forma, un gen codificante de una proteína hipotética, catalogado en este estudio como “group_128”, se encontró presente en las cepas colonizantes de P. aeruginosa. La caracterización de estos genes y su validación en cohortes más amplias podría contribuir al desarrollo de marcadores diagnósticos y pronósticos en este perfil de pacientes, contribuyendo a la optimización del uso de antimicrobianos y la reducción de la morbimortalidad asociada a la colonización por microrganismos multirresistentes.

PALABRAS CLAVE

Genómica, secuenciación completa del genoma, colonización, marcadores genéticos, programas de optimización del uso de los antimicrobianos.

ABSTRACT

Colonization by multidrug-resistant microorganisms in critically ill patients or those with onco-hematological diseases is a risk factor for the development of infections, leading to an increase in hospital stay, healthcare costs, and morbidity and mortality. Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa are particularly relevant in this regard due to their high prevalence as human pathogens, presence of multidrug resistance, and virulence factors. This study evaluated the relationship between the pangenome of each of these two species and their presence as colonizers or infectious agents in clinical samples. Whole-genome sequencing was used. Bioinformatic analyses included quality control, assembly, structural and functional annotation, pangenome calculation, and a genome-wide association study. All samples passed the necessary quality controls. Pangenome analysis revealed an accessory genome of approximately 65% in K. pneumoniae and 50% in P. aeruginosa. The flmA gene in K. pneumoniae was found in infection-causing strains compared to those that were merely colonizers, with statistical significance. Similarly, a gene encoding a hypothetical protein, identified in this study as «group_128,» was found in colonizing strains of P. aeruginosa. Characterizing these genes and validating them in larger cohorts could contribute to the development of diagnostic and prognostic markers in this patient profile, helping optimize antimicrobial use and reduce morbidity and mortality associated with colonization by multidrug-resistant microorganisms.

KEY WORDS

Genomics, whole genome sequencing, asymptomatic infections, genetic markers, antimicrobial stewardship.

INTRODUCCIÓN

La colonización humana con bacterias multirresistentes es un factor de riesgo reconocido para el desarrollo de infección por estos microorganismos en ciertas poblaciones con factores de riesgo, especialmente inmunosupresión, patologías onco-hematológicas y estancias prolongadas en unidades de cuidados intensivos¹. El desarrollo de infecciones por bacterias multirresistentes supone un aumento en los tiempos de ingreso hospitalario, un aumento de la morbimortalidad y un incremento de los costes al sistema sanitario. En este sentido, un estudio publicado en 2020 por Zhen y colaboradores, muestra como las infecciones causadas por Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos (KPRC) y Pseudomonas aeruginosa resistente a carbapenémicos (PARC) en un hospital terciario se tradujeron en un incremento promedio de la mortalidad, días de ingreso hospitalario y costes del sistema sanitario de 5%, 10 días y 10.000 dólares respectivamente².

En un estudio reciente publicado por Shiqi y colaboradores, se concluye que los procedimientos invasivos, la cirugía, la enfermedad subyacente, el uso de antibióticos, el historial de ingreso en la unidad de cuidados intensivos, la edad avanzada, la gravedad de la enfermedad primaria, el estado comatoso y la insuficiencia renal aguda se han asociado con infecciones secundarias en portadores asintomáticos colonizados por KPRC³. De la misma forma, en el estudio realizado por Zhang y colaboradores, encuentran que los factores de riesgo para la infección o colonización por PARC fueron la exposición previa a carbapenémicos, los días de tratamiento con carbapenémicos y el aislamiento concurrente con Escherichia coli resistente a carbapenémicos⁴.

Aunque el factor más importante en la transición de la colonización a la infección es el estado inmunológico del huésped, podrían existir ciertas características que facilitan el desarrollo de la infección por cepas particulares, explicando la existencia de secuenciotipos de riesgo. Se esperaría que esos rasgos diferenciales formen parte del genoma accesorio de dichas cepas o se manifiestan como cambios transcripcionales, como lo sugieren r D’Arpa y colaboradores⁵.

El pangenoma hace referencia al conjunto de ortólogos y/o genes únicos de un grupo específico de microorganismos y consta de una genoma central o nuclear (presente en >=99% de todos los aislados) y un genoma accesorio (presente en <99% de todos los aislados)⁶.

K. pneumoniae y P. aeruginosa son bacterias gramnegativas que comparten características importantes en cuanto a su dinámica en el entorno clínico. Ambas son prevalentes en la colonización e infección humana, pueden albergar una gran cantidad de determinantes de resistencia a los antibióticos y poseen un pan-genoma abierto con un gran conjunto de genes accesorios. El siguiente trabajo tiene como objetivo identificar una relación entre genes accesorios específicos en los genomas accesorios de K. pneumoniae y P. aeruginosa multirresistentes y su relación con la colonización o infección en pacientes hospitalizados.

MÉTODO

Se seleccionaron para secuenciación de genoma completo un conjunto de 43 cepas de K. pneumoniae y 30 de P. aeruginosa, aisladas entre enero de 2022 y octubre de 2023 en hospitales de la comunidad autónoma de Aragón. La identificación inicial se realizó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Posteriormente se realizó un subcultivo en agar sangre incubado durante 24 horas a 35°C para aumentar la biomasa del cultivo y posterior extracción de ácidos nucleicos empleando un método de captura magnética en un instrumento MagCore® (RBC Bioscience). La cuantificación del ADN extraído se realizó mediante Qubit® (ThermofisherScientific). La construcción de las librerías se realizó con el kit Nextera® XT DNA (Illumina), evaluando la concentración y calidad de los fragmentos mediante Qubit® y Bioanalyzer® (Aligent). La secuenciación se llevó a cabo en un instrumento MiSeq® (Illumina) con un protocolo de 300 ciclos y lecturas pareadas en un cartucho v2-300. La evaluación y mejora de la calidad de las lecturas crudas se realizó con Fastqc v0.11.9 y trimmomatic v0.39. Los genomas se ensamblaron utilizando Unicycler v0.5.0 con las opciones predeterminadas; la evaluación cuantitativa y cualitativa de los contigs se realizó mediante QUAST v5.2 y BUSCO v5.6, siendo posteriormente anotados funcional y estructuralmente mediante prokka v1.14.6. El fichero resultante de la anotación se empleó para el cálculo del pan-genoma de cada especie mediante roary v3.13.0. Adicionalmente se realizó un estudio de asociación de genoma completo (GWAS) utilizando la salida de roary como entrada de socary v1.6.16, proporcionando el estado de colonización para cada aislado. Finalmente, se realizó una ronda adicional de anotación funcional con sma3s v2, utilizando el conjunto completo de proteínas bacterianas curadas de SwissProt como referencia (https://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/taxonomic_divisions/) y el pan-proteoma inferido de cada especie como entrada.

DISCUSIÓN-CONCLUSIONES

Todas las secuencias superaron los controles de calidad. El número de contigs fue menor a 500 en todos los casos, con una N50 promedio >50.000. El porcentaje de ortólogos en grupos filogenéticos afines fue >98% en todas las muestras, correspondiendo con un ensamblado funcionalmente adecuado. A nivel estructural, el número de CDS, rRNA y tRNA encontrados durante el proceso de anotación fue similar al reportado en los genomas de referencia de las especies incluidas en el estudio.

El pan-genoma de las 43 cepas de K. pneumoniae consistió en 11,114 genes, de los cuales 3,869 corresponden al genoma central y 4,528 se clasificaron como genes accesorios. En el caso de P. aeruginosa, se encontraron un total de 5,004 genes centrales y 4,172 accesorios, de un total de 11,398 genes (Figuras 1 y 2). Se encontraron grupos de genes accesorios específicos presentes en cepas estrechamente relacionadas en ambas especies (Figuras 3 y 4). Estos resultados están en congruencia con los hallazgos encontrados en otros trabajos, como el Sundaresan y cols en K. penumoniae y el de Freschi y cols en el caso de P. aeruginosa, en los que se muestra como elementos del genoma accesorio de estas bacterias pueden jugar un papel fundamental en la adquisición de rasgos fenotípicos necesarios para su desarrollo en nichos específicos, incluyendo factores de virulencia^7,8.

El resultado del GWAS para K. pneumoniae sugirió que el gen “group_3014” estaba ausente en las cepas colonizadoras p<0.01, mientras que en el caso de P. aeruginosa “group_128”, que codifica una proteína hipotética, estaba presente preferentemente en las cepas colonizadoras p<0.01. La anotación funcional mostró que “group_3014” probablemente corresponde al gen flmA, que codifica una proteína de herencia estable de plásmidos. No se encontraron coincidencias en la anotación funcional masiva para “group_128”.

A la fecha son pocos los estudios que vinculan las características genómicas de estas especies bacterianas con su posible papel en la transición de colonización a infección en humanos. La importancia de encontrar estos factores genéticos, radica en su posible empleo como marcadores clínicos que permitan evaluar el riesgo de infección en pacientes de alto riesgo colonizados por estos microorganismos, ayudando en los programas de control de infecciones y optimización de antibióticos, limitando el uso indiscriminado de antibióticos en unidades críticas. Otra utilidad potencial de encontrar estos marcadores, sería contribuir en el desarrollo de nuevas moléculas que permitan modificar puntualmente el acervo genético de clones bacterianos de alto riesgo, con el fin de mitigar la probabilidad de desarrollar infección, sin la necesidad de emplear antibióticos de amplio espectro, con el consecuente beneficio sobre la microbiota intestinal de los pacientes y la epidemiología de microorganismos multirresistentes en los hospitales.

Nuestro estudio sugiere la presencia de genes en el genoma accesorio de K. pneumoniae y P. aeruginosa que podrían estar relacionados con la colonización e infección en pacientes hospitalizados; sin embargo, son necesarios más estudios para respaldar estos hallazgos y para esclarecer el papel de estos genes en su interacción con el humano.

BIBLIOGRAFÍA

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2. Zhen X, Stålsby Lundborg C, Sun X, Gu S, Dong H. Clinical and Economic Burden of Carbapenem-Resistant Infection or Colonization Caused by Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii: A Multicenter Study in China. Antibiotics (Basel). 2020;9(8):514. Published 2020 Aug 13. doi:10.3390/antibiotics9080514
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5. D’Arpa P, Karna SLR, Chen T, Leung KP. Pseudomonas aeruginosa transcriptome adaptations from colonization to biofilm infection of skin wounds. Sci Rep. 2021;11(1):20632. Published 2021 Oct 19. doi:10.1038/s41598-021-00073-4
6. Costa SS, Guimarães LC, Silva A, Soares SC, Baraúna RA. First Steps in the Analysis of Prokaryotic Pan-Genomes. Bioinform Biol Insights. 2020;14:1177932220938064. Published 2020 Aug 7. doi:10.1177/1177932220938064
7. Sundaresan AK, Gangwar J, Murugavel A, Malli Mohan GB, Ramakrishnan J. Complete genome sequence, phenotypic correlation and pangenome analysis of uropathogenic Klebsiella spp. AMB Express. 2024;14(1):78. Published 2024 Jul 4. doi:10.1186/s13568-024-01737-w
8. Freschi L, Vincent AT, Jeukens J, et al. The Pseudomonas aeruginosa Pan-Genome Provides New Insights on Its Population Structure, Horizontal Gene Transfer, and Pathogenicity. Genome Biol Evol. 2019;11(1):109-120. Published 2019 Jan 1. doi:10.1093/gbe/evy259

ANEXOS

Figuras:

Figura1. Distribución del pangenoma de K. pneumoniae.

Figura2. Distribución del pangenoma de P. aeruginosa.

Figura3. Matriz de distribución de genes según la relación filogenética de los aislados en K. pneumoniae.

Figura4. Matriz de distribución de genes según la relación filogenética de los aislados en P. aeruginosa.