Base molecular del dopaje genético con proteínas recombinantes. Aplicación de la eritropoyetina. Revisión bibliográfica.

AUTORES

1. Lorena Cartiel Marina. Grado en Fisioterapia, Hospital Royo Villanova, Zaragoza.
2. Alberto Garcia Verdes. Grado en Fisioterapia. Clinica Mas Salud, Sigüenza
3. Estela Meléndez Sánchez. Grado en Enfermería, Hospital Clínico Universitario, Lozano Blesa, Zaragoza.
4. Francisco Javier Monserrat Cantera. Grado de Fisioterapia, Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza
5. Ainhoa Bartumeus Bartolomé. Licenciada en Psicología, C.S. San José Norte, Zaragoza.
6. José Antonio Ortín Clavería. Grado de Fisioterapia, Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.

 

RESUMEN

El dopaje genético es definido según la Agencia Mundial Anti-dopaje como el uso no terapéutico de genes, elementos genéticos o sustancias ilegales que son capaces de mejorar la capacidad física de un deportista.

La eritropoyetina es una glicoproteína acídica compuesta por 165 aminoácidos, sintetizada mayoritariamente en los riñones y en menor proporción en la médula ósea, el bazo y el hígado. Gracias al desarrollo de la ingeniería genética, cada vez es más habitual la presencia de esta proteína tanto en el ámbito sanitario, como en el deportivo siendo usada como método de dopaje.

En el presente trabajo, se expone la estructura, biosíntesis, función de la proteína, sus diferentes indicaciones clínicas, y los efectos adversos que conllevan un abuso de esta proteína (dentro de los cuales se encuentra el cáncer).

En relación con el deporte, se detalla también los diferentes métodos de detección de esta proteína en los controles antidopaje (los cuales son cada vez más exhaustivos), y también los derivados de la eritropoyetina como opción de sustancia dopante que tiene un efecto más duradero en el organismo y es más difícil de ser detectada.

De esta manera se trata de acercar al lector al mundo del dopaje y su relación directa con el ámbito del deporte, y se informa acerca de los avances que se están llevando a cabo para conseguir una competición pura y limpia en todo momento.

 

PALABRAS CLAVE

Eritropoyetina, dopaje genético, eritropoyesis, proteínas recombinantes, deporte, rendimiento físico.

 

ABSTRACT

Gene doping is defined by the World Anti-doping Agency as the non-therapeutic use of genes, genetic elements or illegal substances that have the capacity to enhance the athletic performance.

Erythropoietin is an acidic glycoprotein composed by 165 amino-acids, synthesized in majority in kidneys and in minor proportion in bone marrow, spleen and liver. Thanks to the development of genetic engineering it is increasingly common the presence of this protein in the scope health and in sport being used like a doping method.

In the present report, it is exposed the structure, biosynthesis, its functions, its different clinical indications and the adverse effects that are produced by the abuse of this protein (within which is cancer).

In relation to sport, there are detailed different detection methods of this protein in the anti-doping controls (within are more exhaustive now), and also erythropoietin derivatives like option of doping substance which has a long-lived effect in the organism and is more difficult its detection.

In this manner, the work hope close lector to the doping world and it direct relation with the scope of sport, and give information about the advances that are being done to have a competition more pure and clean in every moment.

 

KEYWORDS

Erythropoietin, gene doping, erythropoiesis, recombinant proteins, sport, athletic performance.

 

INTRODUCCIÓN

 

INTRODUCCIÓN A LA ERITROPOYETINA (EPO):

La eritropoyetina, comúnmente denominada EPO, es una glicoproteína acídica compuesta por 165 aminoácidos (aas) y que se sintetiza mayoritariamente en los riñones (por las células peritubulares de la corteza y la médula externa) y, en menor proporción es producida por los macrófagos (que se encuentran situados en la médula ósea), el bazo, los ganglios submaxilares y las células de Kupfer hepáticas.

La principal función de la de esta proteína es la de estimular la eritropoyesis; es decir, se encarga de inducir la producción de células sanguíneas (eritrocitos) y, por lo tanto, de aumentar el transporte de oxígeno a través del torrente sanguíneo a todo el organismo.

Las alteraciones en la producción de esta hormona tienen distintas consecuencias a nivel clínico. La más importante es la anemia (la cual es ocasionada por un déficit de EPO) con su consecuente falta de eritrocitos e hipoxia tisular. Dado que existen patologías, como pueden ser los procesos cancerígenos, infecciones y enfermedades inflamatorias intestinales, que cursan con anemia; la EPO se emplea como terapia complementaria al tratamiento propio de este tipo de enfermedades. No sólo se pueden presentar enfermedades debido a un déficit de esta proteína, sino que también puede haber superproducción de ella, y en este caso este aspecto se relaciona con la presencia de tumores en pacientes policitémicos y de quistes renales en algunas hepatopatías crónicas (pielosis hepática).

A pesar de su implicación clínica, en la actualidad esta proteína se está utilizando de forma abusiva e ilegal en el dopaje de deportistas de élite, y cada vez son más frecuentes los casos de atletas que han sido tratados o inyectados con este tipo de sustancia con el objetivo de mejorar su rendimiento y obtener mejores resultados en sus competiciones, marcando de esta manera la gran diferencia entre el deporte justo, y la utilización de agentes externos para alcanzar un mayor hito en lo que a deporte se refiere^1,2.

 

Sustancias y métodos prohibidos en el deporte:

Teniendo en cuenta la cantidad de casos de dopaje detectados en el deporte, la WADA ha creado una lista con los métodos y sustancias prohibidos en la competición deportiva, que ha sido actualizada en septiembre de 2012 y es válida para todo este año deportivo en el que entramos.

Se trata de una extensa lista con numerosos productos y métodos, los cuales se citan a continuación.

 

SUSTANCIAS PROHIBIDAS:

• Sustancias no aprobadas: Cualquier sustancia ilegal que no se encuentra encuadrada en ninguna de las distintas secciones por distintas causas.
• Agentes anabólicos: Entre los cuales se encuentran.
  • Esteroides anabólicos androgénicos (Anabolic Androgenic Steroids, AAS).
  • Hormonas peptídicas, factores de crecimiento y sustancias relacionadas.

Estimulantes de la eritropoyesis (nos centraremos en estas). Entre las cuales se encuentran la EPO, darbopoetina, factores inducidos por la hipoxia (Hipoxia induced factors, HIF), receptor activador continuo de la eritropoyetina (Continuous Erythropoietin Receptor Activator, CERA) y peginesatide (hematide).

Gonadotropina coriónica (Chorionic gonadotropin, CG) y hormona luteinizante (Luteinizing Hormone, LH).

Corticotropinas.

Factores de crecimiento (Growth hormone, GH, Insulin growth factor, IGF).

• • Beta – 2- agonistas.
  • Hormonas y moduladores metabólicos: Hay varios.

Inhibidores de la aromatasa.

Moduladores selectivos del receptor del estrógeno.

Otras sustancias anti-estrogénicas.

Agentes modificantes de la función de la miostatina.

Moduladores metabólicos.

Diuréticos y otros agentes enmascarantes.

También se encuentran prohibidas en la competición las distintas sustancias:

• Estimulantes.
• Narcóticos.
• Cannabinoides.
• Glucocorticoesteroides.

 

MÉTODOS PROHIBIDOS:

• Manipulación de la sangre y sus componentes.
• Manipulación física y química.
• Dopaje genético.

En este trabajo se estudiará uno de los métodos más actuales y efectivo en lo que a deporte se refiere, “el dopaje genético”. El cual como ya se ha ido introduciendo, consiste en el intercambio de una serie de genes o fragmentos de material genético para de esta manera modificar las condiciones fisiológicas de aquellos que son sometidos al proceso.

Además, se hablará también de los distintos métodos que existen en el dopaje genético, y de las distintas proteínas que se utilizan en la actualidad en el ámbito deportivo, aunque desarrollará de entre todas ellas la EPO.

A parte de la implicación de esta proteína en el ámbito deportivo, también se detallará cuáles pueden ser sus efectos adversos o beneficiosos en el mundo de la investigación, y para qué tipo de enfermedades se encuentra indicada la proteína en cuestión.

Por último se especificará en el trabajo cual es la repercusión del dopaje en el ámbito deportivo, como existe la posibilidad de enmascarar los resultados en los controles antidoping.

Con este trabajo lo que se trata de hacer es acercar al lector al mundo del dopaje y las proteínas recombinantes, exponiendo el ejemplo de la EPO, cuyo mecanismo de señalización es aplicable a las demás proteínas, y relacionar de esta manera aplicarlo también al mundo del deporte con el que se encuentra íntimamente relacionado.

 

DOPAJE CON EPO:

En la actualidad se conocen dos métodos de dopaje con la proteína EPO: el dopaje por medio de proteínas recombinantes y el dopaje genético mediante vectores (también denominado transferencia génica).

Proteínas recombinantes:

Se trata de una técnica empleada por los deportistas para conseguir un aumento en el rendimiento de su práctica deportiva.

La síntesis de las proteínas recombinantes no se realiza en el organismo productor de las mismas. Estas son creadas gracias a la biotecnología mediante los procesos de separación, análisis y modificación de determinadas secuencias de ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid, DNA)^9,10.

La tecnología del DNA recombinante (Recombinant DNA, DNAr) tiene un gran papel en la biotecnología y en el dopaje ya que, gracias a la manipulación de genes o secuencias genéticas, es capaz de producir grandes cantidades de proteínas que de manera natural se encuentran en concentraciones bastante más bajas en el organismo.

Para la creación de proteínas recombinantes se necesita: i) un organismo hospedador, que suelen ser bacterias o levaduras y se encargan de facilitar la producción del proceso, ii) un vector y iii) un fragmento de DNA con los elementos génicos necesarios para realizar la transcripción y la traducción en el organismo hospedador.

Las proteínas recombinantes tienen una aplicación muy amplia. Se utilizan para la producción de hormonas, estimuladores de crecimiento, como la hormona de crecimiento bovina (bovine Growth Hormone, bGH) y enzimas, entre otros. Se aplican en la prevención de ciertas enfermedades, en menor medida en el ámbito de la nutrición y, obviamente y cada vez de manera más abusiva, en el mundo del deporte¹⁰.

Su obtención comienza con la amplificación de un fragmento de DNA complementario inicial (Complementary DNA, cDNA), mediante la Reacción en cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR).

 

PCR:

La PCR es una técnica empleada para amplificar secuencias específicas de DNA. Se trata de una forma sencilla y rápida de generar DNA de muestras biológicas, obteniéndose de esta manera miles de copias de esa secuencia seleccionada.

Fue desarrollada por Kary Mullis, basándose en la replicación del DNA de los organismos eucariotas mediante la DNA polimerasa. “La parte a destacar de este proceso es que permite la extracción de pequeños fragmentos, para luego ser amplificados; es decir permite el aislamiento de pequeñas secuencias de DNA de una larga cadena de DNA”. Esta enzima se encarga de realizar la síntesis de una cadena de cDNA en el sentido 5´-3´ utilizando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena.

Hay que señalar que la PCR no forma parte del proceso de obtención de proteínas recombinantes, sino que es el paso anterior y necesario a la obtención de las mismas. Con este proceso lo que se busca es crear el máximo número de fragmentos de DNA para luego introducirlos en las células que se quieren modificar.

Proceso de obtención de proteínas recombinantes:

Una vez amplificada la secuencia de DNA, se lleva a cabo el proceso de obtención de rDNA que se desarrolla en 5 pasos:

• • Cortar secuencias de DNA en los sitios precisos mediante la acción de las endonucleasas de restricción.
  • Seleccionar una pequeña molécula de DNA que tenga la capacidad de ser replicada y cortarla con la misma enzima de restricción.
  • Unir los dos fragmentos de DNA obtenidos por medio de la enzima DNA ligasa, para de esta manera originar el rDNA.
  • Introducir el material genético creado en células, mediante la transfección de las mismas.
  • Seleccionar las células que presentan el material genético que ha sido modificado, mediante la presencia de un antibiótico.

Las endonucleasas de restricción son unas enzimas bacterianas que se encargan de reconocer y cortar en zonas específicas del material genético. Crean fragmentos de DNA cuyos extremos son complementarios a los del vector. Tanto el vector (que suele ser un plásmido) como el DNA se cortan con la misma enzima, por ejemplo la ECO R1.

Tras ser creada la secuencia de DNA que se desea clonar, ésta se unirá al vector seleccionado mediante la acción de otra enzima, la DNA ligasa, para crear una secuencia de material genético de doble hebra, que se consigue mediante la formación de enlaces fosfodiester 5´- 3´.

La combinación de la secuencia del DNA, junto con el vector, da lugar al rDNA.

La información que se ha obtenido mediante la acción de las distintas enzimas se inserta en los denominados vectores de clonación; entre ellos destacan los plásmidos, los bacteriófagos y los cromosomas bacteriales artificiales, siendo los primeros los más utilizados.

Los plásmidos son moléculas de DNA circular que se replican de manera independiente al cromosoma y que pueden introducirse en las células bacterianas mediante un proceso denominado transfección. Éste se basa en el uso detergentes que forman minúsculos poros en su membrana, mediante los cuales se introduce el material genético.

Para poder seleccionar las células transfectadas, dichos vectores cuentan con uno o varios genes de resistencia a antibióticos en su secuencia. Tras la incubación de las células con dicho antibiótico, solo sobrevivirán aquellas que han sido transfectadas ^(13).

Las proteínas recombinantes pueden ser expresadas, además de en cultivos celulares de bacterias, en levaduras, hongos, mamíferos, plantas e insectos. La recombinación de genes humanos en bacterias es una técnica de gran valor porque las bacterias se reproducen rápidamente y pueden duplicar su número cada 20 minutos. De esta forma se pueden obtener en poco tiempo muchas copias del gen humano inserto en el DNA bacteriano y producir grandes cantidades de proteínas recombinantes.

A escala industrial, la producción de proteínas recombinantes involucra las siguientes etapas:

• Fermentación: las bacterias son cultivadas en tanques sellados (fermentadores) que contienen un medio de cultivo nutritivo.
• Extracción: las células son centrifugadas para recuperar las proteínas de su interior.
• Purificación: se separa la proteína recombinante de las otras proteínas bacterianas.
• Formulación: la proteína recombinante se modifica para conseguir una forma estable y estéril que puede administrarse terapéuticamente.

Cada una de las fases de la elaboración implica un manejo muy cuidadoso de los materiales y un estricto control de calidad para optimizar la extracción, la pureza, la actividad y la estabilidad del fármaco.

La identificación, aislamiento y clonación del gen de la EPO humana impulsó la elaboración de proteínas recombinantes. Inicialmente se probó con Escherichia coli, pero se obtuvo una hormona carente de carbohidratos y sin actividad biológica in vivo. Posteriormente, el gen de la EPO humana se incorporó a células ováricas de hámster chino; el cultivo de estas células in vitro produce en el medio de cultivo abundantes cantidades de la hormona, que posteriormente se purifica por cromatografía ^(11).

En la actualidad el abuso de éstas proteínas sigue en avance, siempre con el objetivo de lograr beneficios mayores, amenazando de esta manera la competitividad justa que caracteriza el deporte y manchando cada día de nuevos y sorprendentes casos ^(10).

Su similitud con las proteínas endógenas y los grandes efectos que provocan en el organismo, hacen que su uso en el ámbito deportivo vaya en aumento según pasa el tiempo, haciendo de esta manera menos justa la competición y dejando de premiar aquel que trabaja para conseguir su objetivo de manera natural^3.

Teniendo en cuenta que este trabajo se centra en la proteína específica de la EPO, un claro ejemplo de proteína recombinante sería el de la (recombinant human erythropoietin, rhuEPO. La rhuEPO comenzó a utilizarse hace veinte años, sobre todo en los deportes aeróbicos (los que corresponden a las competiciones de fondo), con el objetivo de aumentar la resistencia del deportista. Se utilizó masivamente por su similitud estructural con la EPO producida de manera endógena, por su baja o casi mínima concentración en el organismo, porque no induce la formación de anticuerpos y por su corto periodo de vida, lo que dificulta enormemente su detección en los controles antidopaje⁵.

Han existido diversas generaciones de proteínas recombinantes. En la actualidad, las proteínas de última generación presentan un efecto más prolongado en el organismo (mayor vida media) y son más difíciles de detectar. De ahí la existencia de un número mayor de controles antidopaje en todo tipo de competiciones deportivas (dado que su uso no sólo se ciñe a un tipo específico de deportes) y más exhaustivos aún de lo que anteriormente eran.

 

Dopaje genético mediante vectores (transferencia génica):

Se define la terapia génica como “la transferencia de células, genes o fragmentos de material genético o agentes farmacológicos de manera artificial para de esta manera modular la expresión de los genes endógenos, y que el material transferido a las células dañadas sirva para tratar distintos tipos de enfermedades”. En la actualidad sobre todo se utiliza para tratar desórdenes genéticos, como la hemofilia A y B, la fibrosis quística o enfermedades isquémicas del corazón entre otras.

El dopaje genético es un método innovador que comenzó a ser utilizado en el siglo XX. Persigue que ciertos genes se expresan en mayor proporción que otros en los deportistas, para de esta manera aumentar el rendimiento atlético del deportista sometido al dopaje genético^14,15.

Esta unión entre la terapia génica y el deporte es más que evidente aún si se tiene en cuenta que los primeros estudios en este ámbito fueron realizados con proteínas típicas de los casos de dopaje como son la EPO o la GH^15.

Por ello es necesario que se desarrollen técnicas moleculares específicas que sean capaces de detectar esas diferencias genéticas introducidas de manera artificial en el genoma del atleta, y así combatir contra la trama del dopaje^14.

Se pueden diferenciar dos métodos distintos de transferencia de genes, los cuales sustituyen a la administración de drogas eritropoyéticas; estos dos métodos son:

• • Método ex vivo: Se trata del método en el cual los genes se transfieren a células en cultivo que han sido extraídas y aisladas del tejido, mantenidas en cultivo y sometidas al proceso de transfección in vitro con vectores apropiados.
  • Método in vivo: En este método los genes se transfieren mediante vectores directamente al sujeto de estudio, sin que haya extracción ni manipulación in vitro; existen tres formas de introducción: intravenosa (i.v), intramuscular (i.m) e intradérmica (i.d).

La principal ventaja de este método sobre la terapia génica ex vivo es su gran sencillez. A pesar de ello, también presenta algunos inconvenientes. El primero es que no hay un gran control del proceso de transferencia génica; el segundo es la menor eficiencia, dado que no se pueden amplificar las células que han sufrido la transfección; y el tercer y último inconveniente es la dificultad de obtener una alta especificidad tisular.

Una de las variantes de este método es la transferencia in situ, en la cual el tratamiento se realiza directamente sobre un tejido en particular. Para este método se suelen usar vectores virales recombinantes para transferir los genes a un alto nivel de expresión potencial^14,16,17.

La transferencia génica requiere un buen desarrollo tecnológico y un amplio conocimiento de la genética. Es fundamental la elección del vector (de naturaleza viral o no viral) y un buen manejo de las técnicas de transferencia^12.

El material genético que normalmente se utiliza en la transferencia génica es el DNA, ácido ribonucleico (Ribonucleic Acid, RNA) o células dañadas. El gen transferido debe llevar alguna secuencia promotora que permita su expresión y también ha de ir acompañado de un marcador para de esta manera identificar las células a las que se ha de incorporar la información genética. A continuación, se transfieren esas células con el gen incorporado al sujeto y se espera a que actúe en el organismo.

Posiblemente el paso más difícil en el proceso de la transferencia génica sea la elección del vector. Estos pueden ser de dos tipos:^14,15.

• • No virales.
  • Virales.

Los vectores no virales más típicos son los liposomas y se caracterizan por su fácil producción, su baja toxicidad y poca inmunogenicidad.

Por ello, como variante a los vectores no virales, aparecen los vectores virales. En este método de transfección génica todos los genes virales de proteínas patogénicas son eliminados y reemplazados por genes sanos. Pero no son todo ventajas, ya que los vectores virales en ocasiones pueden tener efectos secundarios que pueden afectar de manera muy grave al organismo o incluso ser letales si el proceso realizado no se desarrolla según lo esperado.

 

ESTRUCTURA DE LA EPO:

La EPO es una glicoproteína, miembro de la familia de las citoquinas de tipo I. Posee una estructura globular compacta de cuatro hélices que se encuentran conectadas mediante una serie de bucles^5,18,19.

Esta glicoproteína se produce de manera mayoritaria en los riñones, en respuesta a la hipoxia. Debido a esto, se estimula el gen de la EPO aumentando el nivel de la hormona. Su función principal es la de estimular la formación de eritrocitos, estimulando la eritropoyesis^15,17,20.

La EPO es un péptido formado por 166 aas, aunque debido al procesamiento del precursor pierde una arginina (Arg) en el C terminal, quedando de esta manera una hormoglicoproteína de 165 aas (que es la que se describe habitualmente). Además esta proteína posee sitios específicos de unión para el receptor de la EPO (EPOR)^5,17,18,19.

 

BIOSÍNTESIS DE LA EPO:

La eritropoyetina es una proteína que durante el desarrollo fetal se sintetiza de forma mayoritaria en el hígado, por los hepatocitos y las células intersticiales, y que empieza a formarse en los riñones en el último periodo del embarazo. Sin embargo, tras el nacimiento, el 80% de su producción tiene lugar en los riñones, a nivel de los túbulos proximales y en los fibroblastos peritubulares.

El determinante de la producción de EPO es la cantidad de oxígeno en sangre. Existen sensores renales que ante la disminución de O₂ aumentan la producción de EPO, entre los cuales pueden encontrarse las prostaglandinas, los andrógenos… ¹.

Gen de la eritropoyetina:

El gen de la EPO humana está presente como una copia simple en el cromosoma 7, en la región q11-q22 del genoma. Existe una elevada homología entre el gen de la EPO del mono (90%) y del ratón (80%) con el gen humano.

El gen de la EPO presenta 5 exones y 4 intrones dando lugar a la pro-EPO, que está constituida por 193 aas. Tras los numerosos cambios conformacionales se generará la proteína EPO.

El gen se encuentra bajo el control de muchos factores de transcripción. GATA- 2 y NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), son dos de esos factores que actúan inhibiendo la expresión del gen que codifica la eritropoyetina¹⁷.

 

ACCIONES BIOLÓGICAS: ERITROPOYESIS Y MECANISMO DE ACCIÓN (SEÑALIZACIÓN):

Eritropoyesis:

La eritropoyesis es un complejo proceso fisiológico, por el cual las células precursoras eritroides se dividen, proliferan y se diferencian, dando lugar a la formación de los eritrocitos o glóbulos rojos (Red Blood Cells, RBCs).

Mecanismo de acción (Señalización):

La EPO interacciona en las células eritroides con un receptor de membrana, específico y saturable. Éste forma parte de una superfamilia de receptores para citoquinas. El EPOR es un polipéptido (66 a 78kDa) de 507 aminoácidos que posee 3 dominios: un dominio extracelular de unión a la EPO que tiene 223 aminoácidos; un dominio transmembrana de 24 aminoácidos; y un dominio citoplasmático de 236 aminoácidos. Como otros miembros de la superfamilia de receptores para citoquinas, poseen 4 cisteínas y un motivo triptófano-serina-X-triptofano-serina (WSXWS), en el que X es un aminoácido cualquiera, en el dominio extracelular. El receptor de EPO posee además un quinto residuo de cisteína, del que carecen los otros miembros de la superfamilia. El dominio citoplasmático del receptor posee 2 regiones con funciones opuestas; una región próxima a la membrana de 103 aminoácidos, que transduce las señales proliferativas, y una región carboxi-terminal de 40 aminoácidos, que las inhibe o regula en descenso²³.

El receptor de la EPO se encuentra en la superficie de las células eritroides progenitoras. La unión de la EPO activa a EPOR induciendo su dimerización y el cambio conformacional necesario para la activación de esta vía^1,18,21. Dicha activación está mediada por la fosforilación de la proteína JAK2 (Janus tirosina quinasa 2), que se encuentra unida al receptor en el dominio de transmembrana. La JAK2 fosforila ocho residuos tirosina en el dominio citoplasmático de EPOR, que sirven como sitios de anclaje para varias proteínas de señalización intracelular que contienen dominios SH2. Estas proteínas son a su vez fosforiladas y activadas en sus residuos tirosina.

Una de estas proteínas es el señalizador de transducción y activador de la transcripción 5 ó STAT5, que se disocia de EPOR y se transloca al núcleo para activar numerosos genes diana, tales como el Bcl-xL (B-cell leukemia–2), que es un inhibidor de la apoptosis. La expresión de la proteína STAT5 declina rápidamente en los estadios finales de maduración eritroide.

 

FACTORES QUE MODULAN LA PRODUCCIÓN DE EPO: FACTOR INDUCIBLE POR HIPOXIA (HIF):

Numerosos factores son los desencadenantes de la producción de eritropoyetina, entre los cuales se encuentran la angiotensina II que se encarga de aumentar la cantidad de EPO en plasma; otro factor sería el aumento del flujo sanguíneo y otro serían los sitios extra-renales que también se encargan de producir esta proteína, aunque el principal factor productor de eritropoyetina en el riñón es la hipoxia; se ha llegado a describir hasta un aumento del 50% en su producción. La hipoxia puede surgir por diversas causas^18,22,25,26:

• • Disminución de la presión de O₂ ambiental.
  • Disminución del transporte de oxígeno a nivel alveolar.
  • Disminución de la capacidad de transporte oxigénico.
  • Disminución del flujo renal.

 

INDICACIONES CLÍNICAS DE LA ERITROPOYETINA:

La aplicación de la eritropoyetina está indicada en distintos tipos de patologías, que quedan reflejadas en el gráfico. De forma más frecuente (sobre un 84% de los ensayos revisados) se utiliza para el tratamiento de la anemia, ya sea de origen renal, no renal o relacionada con el cáncer.

 

EFECTOS ADVERSOS DE LA EPO. CÁNCER:

El uso clínico de la eritropoyetina presenta, tal y como se ha indicado anteriormente, efectos beneficiosos, sobre todo en lo que se refiere al tratamiento de las anemias. Pero también hay que destacar que cuenta con distintos efectos adversos, dentro de los cuales el más relevante sería el cáncer.

A este respecto, una de las primeras cuestiones planteadas fue desvelar si las células tumorales presentan o no EPORs y si estas células promueven la producción de la proteína. Estudios iniciales in vitro realizados en células tumorales no demostraron que la rhuEPO fuera capaz de estimular el crecimiento de las mismas¹⁹. Pero gracias a la realización de diversos ensayos clínicos a posteriori, se pudieron obtener datos acerca de cómo la EPO puede influir en la estimulación del crecimiento de un tumor³¹.

Trabajos posteriores han demostrado la presencia del EPOR en carcinomas de pulmón, cuello de útero, hígado, riñón y órganos reproductores, entre otros. Además se ha demostrado que la estimulación por EPO de líneas celulares cancerígenas y de células endoteliales microvasculares puede generar una señal de transducción ^{(19, 31, 32).}

La presencia de EPOR en los tejidos tumorales podría estar incrementando las posibilidades de aparición de un cáncer. Esta hipótesis es sopesada por diversos ensayos clínicos, los cuales muestran un menor índice de supervivencia en aquellos pacientes con cáncer que han sido tratados con rhuEPO³¹. Además de esos efectos en las células tumorales, la EPO podría ser capaz de estimular la proliferación de un tumor por su efecto angiogénico (formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes), por inhibir la apoptosis celular o también mediante la inducción de cualquiera de los factores que favorecen la proliferación de un tumor^31,32.

A parte del principal efecto adverso del cáncer, la administración de la eritropoyetina cuenta con otros muchos efectos entre los cuales se encuentran los siguientes^15,19,30:

• Aplasia de las células rojas en pacientes con insuficiencia renal crónica.
• Hipertensión arterial.
• Trombosis.
• Efectos sobre el SNC.
• Síntomas gripales.
• Reacciones cutáneas.
• Alteraciones hidroelectrolíticas: Hipercalciemia, hiperfosfatemia.

 

MÉTODOS DE DETECCIÓN DEL DOPAJE:

Métodos indirectos:

Los métodos indirectos requieren de una extracción sanguínea, debido a que los parámetros se determinan en sangre o suero. El gran inconveniente de estos métodos es la imposibilidad de una muestra de contraanálisis, dada la inestabilidad de los parámetros sanguíneos. Presentan como ventaja que son métodos rápidos y relativamente baratos. En la actualidad se usan como base de medidas y sanciones, especialmente con la introducción del ABP (Athletes Biological Passport) por parte de la UCI (Unión Ciclista Internacional) ^{(19, 34).}

El análisis en sangre se basa en la determinación de tres parámetros hematológicos: hematocrito, hemoglobina y reticulocitos. Algunos de estos parámetros pueden permanecer aumentados hasta cuatro semanas tras la administración de EPO, haciendo posible la detección del dopaje⁴.

Métodos directos:

La detección directa de la EPO generalmente se lleva a cabo en sangre o en orina, presentando la ventaja de la fácil obtención de la muestra biológica a analizar; la extracción de tejido en el dopaje genético, es una excepción. Por el contrario, presentan la desventaja del elevado precio de su realización, así como su baja sensibilidad. Además hay que tener en cuenta un problema añadido: la EPO recombinante humana (rhuEPO) es prácticamente igual, en lo que a estructura se refiere, a la EPO endógena (EPOe)^4,25,33.

 

DERIVADOS DE LA EPO: AGENTES ESTIMULANTES DE LA ERITROPOYESIS (ESAs) QUE SE UNEN A SU RECEPTOR (EPOR):

Todas las epoetinas poseen una secuencia de aminoácidos similar a la de la EPO endógena (EPOe), aunque con un patrón de glicosilación distinto. Para diferenciarlas, y de acuerdo con la Organización Internacional de la Salud (WHO), se les añade como sufijo una letra griega a cada una de ellas^17,19.

Los derivados de la EPO se pueden diferenciar en dos grandes grupos, según el tiempo de permanencia en el organismo en el que se introducen³⁶.

• ESAs de corta duración: Dentro de las cuales se encuentran las epoetinas.
• ESAs de larga duración: Entre las que se encuentran la darbopoetina α y la CERA (Continuous Erythropoietin Receptor Activator).

Epoetina α:

Se trata de la primera proteína recombinante introducida en 1989 en el ámbito comercial (sobre todo en Estados Unidos y la Unión Europea). Junto a la epoetina β forma parte de las denominadas proteínas recombinantes de primera generación^17,19,21.

Producida a partir de cultivos de una línea celular del ovario de hámster chino (Cricetulus griseus) llamada CHO (Chinese Hamster Ovary), que son transfectados con el gen EPO. Esta proteína posee la misma secuencia de aas que la EPOe, pero los diferentes procesos de manipulación que sufre hacen que aumente su masa molecular con respecto a la rhuEPO^5,19,21,37.

La vida media epoetina α en el organismo es equivalente a la epoetina β, siendo de unas 6-8 horas cuando su administración es intravenosa (i.v) y de 19-24 horas si la administración es subcutánea (s.c).

Su administración se suele realizar dos o tres veces a la semana. Se suele aplicar en casos de anemias de origen renal a pacientes sujetos a hemodiálisis, cuando el objetivo que buscamos es el de aumentar la concentración de hemoglobina en sangre³⁷.

Epoetina β:

Se trata de la otra rhuEPO de primera generación, aunque su uso comercial fue algo más tardío que la α, fue en 1990 bajo el nombre de Recormon y sólo era disponible fuera de USA^17,19.

Epoetina ω:

Es una proteína producida en una línea celular de las células renales de hamster dorado sirio (Mesocricetus auratus), conocida como células BHK (Baby Hamster Kidney), que difiere de las otras epoetinas por su perfil de glicosilación. El número de isoformas básicas es también mayor que el de la epoetina β y tan solo el 60% de las isoformas tiene O-glicanos. También se observan en su estructura N-glicanos con restos de manosa; estos N-glicanos están sulfatados, fosforilados y contienen más residuos de Neu5Ac (ácido N-acetilneuramínico)^{5, 19, 20, 21}.

Su primer nombre comercial fue Epomax y su comercialización se extendió a Asia, Europa del Este y América Central, aunque en la actualidad sólo se comercializa en el sur de Asia ^{19,20 ,21}.

Epoetina δ:

Se trata de la cuarta epoetina más usada en el ámbito comercial y recibe el nombre de Dynepo. Se produce en células cultivadas de fibrosarcoma humano (HT-1080) y se usa principalmente en el tratamiento de las enfermedades crónicas renales. En relación a las demás epoetinas, es capaz de sintetizar ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) y contiene un mayor número de isoformas que ellas. Se puede diferenciar del resto de epoetinas mediante el método de detección SDS-PAGE, ya que presenta un perfil muy diferente^17,19.

 

MATERIAL Y MÉTODO

Para la realización de este trabajo de fin de grado, han sido cuatro las principales fuentes para la recogida de información necesaria:

• Base de datos de Biomedicina Pubmed.
• Literatura gris de Bioquímica y Fisiología.
• Artículos proporcionados por la tutora del trabajo.
• Artículos científicos encontrados en Google Académico.

La búsqueda de artículos se ha llevado a cabo en dos fases, debido a la estructura por puntos del trabajo; la primera de ellas fue la búsqueda de artículos para la introducción, en la cual se buscó información sobre el dopaje su historia y algo de información sobre la EPO. Y también se lleva a cabo una segunda fase de búsqueda para la realización del cuerpo del trabajo y su orientación hacia la proteína en cuestión tratada en el trabajo, la eritropoyetina.

Al tratarse de un trabajo científico en el que la bioquímica es el aspecto a tratar, la base de datos (BD) utilizada para encontrar la información es Pubmed, la BD de biomedicina más completa de la actualidad y con ensayos clínicos (ECAs) a su disposición. A pesar de ello se han realizado búsquedas de datos en otras bases de datos de fisioterapia como Cochrane o PeDro aunque sin éxito alguno.

Para desarrollar la fase inicial de búsqueda del trabajo (es decir la de la introducción), se realizan búsquedas sobre todo en Google Académico, introduciéndose los términos de “historia del dopaje” y “definición del dopaje” ; los resultados encontrados son inmensos, pero se pone una serie de requisito para seleccionar la información más adecuada, es decir que sean del año 2000 en adelante, que superen la escala Caspe… y los artículos que se seleccionan son cuatro; además se precisa el uso de dos libros para completar los datos encontrados en los artículos.

Pero no solamente se usan esos artículos y esa literatura gris, sino que se utilizan dos artículos de los que han sido proporcionados inicialmente por la tutora. Además para el aspecto del dopaje se consulta la página de la WADA para conocer las sustancias y métodos dopantes prohibidos en la actualidad, los cuales se encuentran en su lista publicada a inicios de este año 2013.

En lo que se refiere a la segunda búsqueda de información para el desarrollo del cuerpo del trabajo, la principal fuente de información es la BDs Pubmed, también han sido empleadas alguna revista, artículos con la evidencia científica suficiente de Google Académico y también se ha consultado el apartado de ECAs de Pubmed para la recogida de diversos datos. Además de esto ha sido necesario el uso de dos libros de la Biblioteca de Ciencias de la Salud de la UAH (Lehninger y Sylverthorn) para completar la información buscada, a parte de algún artículo más proporcionado por la tutora de este trabajo de fin de grado.

La primera búsqueda realizada en Pubmed se hace introduciendo el término eritropoyetina (el cual es el término principal del trabajo) en términos Pubmed, pero la cantidad de resultados obtenidos es de 25876 artículos, por ello para acotar los resultados y facilitar la búsqueda se realiza con el término Mesh.

Al introducir el método Mesh en la base de datos con el término de búsqueda inicial, encontramos 14 resultados, de los cuales se usa solamente uno de ellos, ya que es el que se puede asemejar más a la información que buscamos y es el más completo de todos.

Una vez se introduce este término en el buscador Mesh lo que se hace es introducir encabezados añadidos a la búsqueda del término principal para realizar una búsqueda completa y precisa sobre el tema que se quiere abordar en el trabajo. En el caso de añadir el subtérmino “diagnostic use” se encuentran 17 resultados, de los cuales solamente uno de ellos pasa los requisitos necesarios para la realización del trabajo, mientras que en el caso de “contraindications” se encuentran 16 resultados siendo también solo uno el que utilizamos para el trabajo.

En el caso de añadir “biosynthesis” la cosa cambia, ya que el resultado es algo mayor, de 1396, por ello en este caso se introducen los operadores booleanos para acotar esos resultados; el operador utilizado es “AND”. Este operador se usa con otros aspectos de los cuales se obtienen más resultados y sobre los cuales podemos obtener información. En el caso de añadir “adverse effects” se encuentran 15 resultados siendo útiles tan solo dos de ellos. A parte de unir solo la palabra clave “erythropoietin” con otro término, también se puede combinar con más de un término para que la búsqueda sea aún más completa; esto se realiza en el caso de unir “biosynthesis” con “therapeutic use”, los resultados obtenidos son 121, de los cuales dos son empleados a lo largo del trabajo.

Además de la utilización de Pubmed para la búsqueda de artículos, esta base de datos ha sido muy útil también para la búsqueda de distintos ECAs para conocer las indicaciones clínicas de la eritropoyetina. Se han observado 100 ensayos clínicos para con ellos realizar un estudio estadístico del uso terapéutico de esta proteína; la mayoría de estos proyectos ya acabados y alguno de ellos en fase III (prácticamente terminal).

A parte del uso de la base de datos Pubmed (que ha sido la principal referencia de información en lo que a este punto se refiere), también se ha recurrido a la búsqueda por medio del buscador Google Académico, siempre cumpliéndose los requisitos de ser artículos con publicación posterior al año 2000 (a excepción de un artículo bastante completo y útil) y de tener una base científica probada. En el caso de esta revisión bibliográfica al tratarse de un tema que se encuentra en continua evolución muchos de los artículos no son estudios sino artículos científicos que nos explican el mecanismo de esta proteína (EPO) y sus características. A pesar de ello sí que se han utilizado artículos que son estudios, y aquellos seleccionados, han debido responder a los aspectos evaluados en la escala Caspe, todos han de tener resultados en los que se puedan confiar, estos han de aparecer reflejados en esos estudios, y por último que los datos que se saquen del artículo sean útiles para el desarrollo del trabajo.

Destacar que uno de los artículos ha sido encontrado en un artículo de una publicación de una revista que es el caso de “Fundamento de la reacción de la polimerasa” y otro “Terapia génica” ha sido encontrado en el capítulo de un libro virtual.

Por último decir que también se ha buscado de manera manual y no sólo virtual, para lo cual se ha acudido a la Biblioteca de Ciencias de la Salud en la cual se han recogido dos ejemplares de libros, uno de Bioquímica y el otro de Fisiología, los ya citados “Lehninger” y “Sylverthorn”. Estos han sido utilizados para la introducción de muchos de los aspectos y también para relacionar la eritropoyetina desde el punto de vista de las dos ciencias, tanto la bioquímica como la fisiología respiratoria.

Teniendo en cuenta todos estos aspectos reflejados a lo largo de la metodología del trabajo se han llevado a cabo unos criterios de inclusión y de exclusión para la selección de la mejor bibliografía posible.

Llevando a cabo este riguroso proceso de selección de bibliografía se obtiene un total de 37 referencias, las cuales son empleadas para la realización de los diferentes puntos de los que se encuentra compuesto el trabajo, alternándose la mayoría en varios puntos de éste debido a lo completos que son y a que aportan información sobre más de un aspecto. De esta manera se ha hecho una búsqueda mucho más eficiente y se ha realizado una revisión bibliográfica compuesta por menos referencias bibliográficas pero mucho más completas.

 

RESULTADOS-DISCUSIÓN

El propósito que se ha tratado de lograr con este trabajo, es el de concienciar a todo el mundo de los efectos perjudiciales del dopaje en el ser humano y del abuso que se está realizando en la actualidad sobre todo en el mundo del deporte y cómo afecta éste a las diferentes competiciones empañándolas de injusticia e impureza.

Por esta razón es necesario saber la estructura molecular de la eritropoyetina (en el caso de este proyecto); ya que conociendo el mecanismo molecular de esta proteína, se conoce el de las demás. Además se trata de un tema que se encuentra a la orden del día y cada vez más habitual en la actualidad, de ahí la importancia de poseer una base científica sobre este tema.

La EPO es una proteína acídica de 165 aminoácidos sintetizada sobre todo en el riñón, y algo menos en la médula ósea, bazo e hígado. Su función principal es la de la estimulación de la eritropoyesis, de ahí su uso en diferentes ámbitos como el del dopaje, y de manera directamente relacionada con el deporte, y también en el ámbito sanitario^1,2.

En lo que se refiere al ámbito sanitario, esta proteína es utilizada para el tratamiento de distintas enfermedades, sobre todo el de la anemia de carácter renal; numerosos son los estudios que se realizan sobre esta proteína con el objetivo de utilizarla en ese ámbito y conocer más datos sobre ellas aplicables a la salud³⁰.

A parte del ámbito de la salud, la EPO es principalmente utilizada en el deporte, y ya no es que sea usada, sino que se utiliza de manera ilegal con el objetivo de mejorar la capacidad física de los deportistas. La capacidad que esta proteína posee para aportar O₂ a los músculos de aquel al que se le administra hace que sea muy usada por los deportistas que realizan competiciones de alta resistencia⁵. De gran importancia es saber tanto nosotros como esos deportistas la cantidad de efectos adversos que pueden llegar a producir una mala administración de esta proteína (siendo el principal de ellos el cáncer), de ahí que el conocimiento sobre este aspecto sea de especial importancia^30,31.

En lo que a deporte se refiere, cada día son más las técnicas de control antidopaje usadas por el COI para acabar de una vez con esta oleada de casos de deportistas “ilegales” en la competición, por ello son cada día más lo métodos de detección de las diferentes sustancias y más habituales los controles en las competiciones^4,19.

Debido a esta mejora del sistema antidopaje, la creación de nuevas proteínas que sustituyan a la EPO, teniendo un efecto más duradero y siendo más difíciles de detectar están siendo creadas, de ahí que este tema sea “la pescadilla que se muerde la cola” ya que si se realizan avances por un lado (el legal), también se llevan a cabo estos avances por el ilegal y no se puede llegar a un punto medio^4,37.

 

CONCLUSIÓN

Con este trabajo lo que se ha tratado de hacer es acercar al lector a la actualidad del dopaje y sus distintas repercusiones en los distintos ámbitos y cómo afecta tanto al sistema sanitario, como al deportivo el mal uso de esta proteína.

 

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