AUTORES
- María Dolores Fuentes Marín. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- María López Gómez. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- Ana Cristina Miguel Molinos. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- Marta Sabanza Belloso. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- Gabriel Ciprian Negru. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- Beatriz Jiménez Moraleda. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
RESUMEN
La malaria, también conocida como paludismo, es una enfermedad causada por parásitos del género Plasmodium.
Desde que se describiera por primera vez en 1880, el diagnóstico de esta enfermedad se ha realizado mediante la observación de las distintas formas del parásito en el examen microscópico de extensiones de sangre periférica teñidas con diversos colorantes. Actualmente, esta técnica sigue siendo el método de referencia. Sin embargo, la dificultad que entraña observar parasitemias bajas ha impulsado el desarrollo de nuevas técnicas más sencillas.1
Diagnosticar a tiempo una malaria puede ser vital para el enfermo, ya que la aparición de complicaciones está muy relacionada con la demora de la instauración del tratamiento.1
PALABRAS CLAVE
Malaria, plasmodium, diagnóstico, parasitemia, cromatografía.
ABSTRACT
Malaria, also known as paludism, is a disease caused by parasites of the genus Plasmodium.
Since it was first described in 1880, the diagnosis of this disease has been made by observing the different forms of the parasite in the microscopic examination of peripheral blood films stained with various dyes. Currently, this technique remains the gold standard. However, the difficulty of observing low parasitemias has prompted the development of new, simpler techniques.1
Diagnosing malaria in time can be vital for the patient, since the appearance of complications is closely related to the delay in the initiation of treatment.1
KEY WORDS
Malaria, plasmodium, diagnosis, parasitaemia, chromatography.
INTRODUCCIÓN
La malaria es una enfermedad sistémica producida por parásitos del género Plasmodium, que se transmite al hombre a través de la picadura del mosquito hembra de la familia Anopheles, con un periodo de incubación de 12-14 días tras la picadura (hasta 28 días en el caso de P. malariae). 2,3,4,5,6
La enfermedad se debe al efecto directo de la parasitación de los eritrocitos, cuya invasión supone una modificación de la membrana eritrocitaria. Esto determina una pérdida de su capacidad de deformación, tendencia a la citoadherencia y, finalmente, destrucción eritrocitaria.2,3
Existen cinco especies que causan enfermedad en el hombre: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale y P. knowlesi. 2,3,6
Las especies que producen los cuadros más graves son sobre todo P. falciparum y también P. knowlesi, por ello es tan importante la diferenciación a nivel de especie en el diagnóstico microbiológico.2,3,5,6
La malaria es una enfermedad potencialmente mortal en cuestión de horas por ello es tan importante la rapidez en el diagnóstico.
OBJETIVO
En este artículo se pretenden describir los métodos actualmente disponibles para el diagnóstico de la malaria en el laboratorio de Microbiología, así como poner de manifiesto la importancia del diagnóstico de dicha infección para la rápida actuación e instauración de tratamiento.
METODOLOGÍA
Se lleva a cabo una revisión bibliográfica buscando información relevante en diversos artículos de revistas científico-sanitarias, empleando para ello buscadores en bases de datos como Elsevier y PubMed.
Como buscador de bibliografía y para consulta de términos y vocabulario científico- sanitario, se ha utilizado Google Scholar, páginas web relacionadas con el tema y documentación de organismos oficiales o de gran prestigio en el área de las Ciencias de la Salud y la Microbiología, como OMS (Organización Mundial de la Salud) y SEIMC (Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica).
Por otro lado, se han consultado Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNTs o PTAs) relacionados con el tema, disponibles en la Intranet del Hospital Universitario Miguel Servet de Zaragoza, donde los autores del presente artículo prestan sus servicios, así como también se ha extraído información de los inserts que acompañan a los kits de pruebas que se realizan en dicho centro de trabajo.
Además, se ha seleccionado y extraído información de bibliografía relevante del área de Microbiología relacionada con el tema del presente artículo y disponible en la Biblioteca de la Universidad de Zaragoza.
RESULTADOS
Descripción del género Plasmodium:
El ciclo biológico de las especies del género Plasmodium, agentes causales de la malaria, es bastante complejo.
En dicho ciclo biológico existe un agente vector (la hembra de un mosquito Anopheles) donde el Plasmodium se reproduce sexualmente y un hospedador vertebrado intermediario (el ser humano) en el que se produce la reproducción asexual. 3,4,5,6
La malaria se transmite solo por las hembras de los mosquitos Anopheles, ya que los machos no son hematófagos.3,4,5,6
Cuando el mosquito hembra pica a una persona infectada, toma sangre con gametocitos que se transforman en su interior hasta convertirse en esporozoítos. Una vez que los esporozoítos se han depositado en las glándulas salivares del mosquito al picar a un ser humano sano se los transmite comenzando así la fase de esquizogonia en el hombre. 3,4,5,6
Epidemiología de la malaria:
La malaria es una de las enfermedades importadas que con más frecuencia se diagnostican en España. La mortalidad en viajeros que adquieren la enfermedad oscila alrededor del 2-3%, siendo el principal factor asociado al mal pronóstico el retraso diagnóstico y del inicio del tratamiento antiparasitario.3
La fiebre es uno de los motivos de consulta más frecuente en los viajeros procedentes de regiones tropicales y subtropicales. Toda fiebre en viajeros o inmigrantes procedentes de áreas endémicas es potencialmente malaria hasta que no se demuestre lo contrario y debe ser descartada. 3,7
Las infecciones también pueden ocurrir alrededor de los aeropuertos a través de la importación no reconocida de mosquitos infectados en aviones o equipaje de los viajeros (aeropuerto y malaria de equipaje). La infección a través de la donación de sangre también es posible.7
La malaria está causada por alguna de las siguientes especies de Plasmodium, las cuales se distribuyen de geográficamente de la siguiente forma:
– P. falciparum: la más frecuente y grave. Predomina en África Subsahariana, el Sudeste Asiático e India, Oceanía, Haití y República Dominicana, Sudamérica, y Oriente medio. Período de incubación 7-14 días (más si ha recibido quimioprofilaxis).
– P. vivax: América central, India y Oriente medio. Período de incubación de 10-30 días hasta meses.
– P. ovale y P. malariae: África subsahariana. Período de incubación de 10-30 días hasta meses.
– P. knowlesi: Sudeste asiático.3,7
Los casos de malaria importada suelen presentarse con fiebre, cefalea y dolores articulares, aunque pueden aparecer otros síntomas. 3
Técnicas de microscopía para el diagnóstico de malaria:
El método diagnóstico de elección ante la sospecha de una malaria es el examen microscópico de sangre venosa periférica extraída en un tubo con anticoagulante (EDTA) o sangre capilar obtenida por punción digital, que permite identificar la presencia de parásitos en sangre. Además, confiere información sobre la especie de Plasmodium, el índice de parasitemia y el estadío en el que se encuentran los parásitos. Estos exámenes son la gota gruesa y la extensión fina o frotis.1,2
La muestra de sangre debe extraerse en cuanto se sospeche la malaria, no siendo necesario que el paciente tenga fiebre en ese momento. Se pueden requerir varias muestras para llegar al diagnóstico, ya que, aunque la primera gota gruesa es positiva en el 95% de los casos, no se puede excluir una malaria con sólo una gota gruesa negativa debido a la variación en la parasitemia. Si la primera es negativa y sigue existiendo sospecha clínica hay que realizar otra a las 12-24 horas y una tercera a las 48 horas antes de excluir el diagnóstico.2
La gota gruesa y las extensiones finas o frotis deben de realizarse en menos de 30 minutos desde que se ha extraído la sangre para evitar el deterioro de la morfología de los parásitos de Plasmodium.2
La tinción de Giemsa es la técnica diagnóstica de referencia. Este colorante sirve tanto para la gota gruesa como para el frotis. La necesidad de emplear agua tamponada a pH 7,2 (tanto en la dilución del colorante como en los lavados) se debe a que, con otro pH, puede verse alterada la morfología del parásito Plasmodium, impidiendo la observación de las granulaciones de Schüffner, tan importantes para la diferenciación de la especie. La tinción de Giemsa, para este propósito, tiene buena sensibilidad (92-98%) y especificidad (85-99%).1,2
Tinción de gota gruesa:
– Se recogen 3 ó 4 gotas sobre un portaobjetos y con la esquina de otro se unen en movimientos rápidos, extendiéndose en una capa gruesa y uniforme. La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad de sangre, facilitando la detección de parasitemias bajas y un ahorro de tiempo en el examen, aunque al romperse los eritrocitos resulta difícil la identificación de especie.1
– No fijar con metanol.
– Teñir con colorante de Giemsa al 3% durante 30 min.
– Lavar en agua tamponada a pH 7,2.
Extensión fina o frotis:
– Se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza la extensión en capa fina.
– Fijar con metanol durante 5 min.
– Teñir con colorante de Giemsa al 10% durante 10 min.
– Lavar en agua tamponada a pH 7,2.
Pruebas rápidas de detección de antígenos para el diagnóstico de malaria:
Existen diferentes pruebas de detección de antígeno comercializadas en formato de Inmunocromatografía que se realiza en una tira de nitrocelulosa o en tarjeta que posee bandas de anticuerpos monoclonales específicos frente al antígeno que se busca.1,2
La mayoría de estas pruebas detectan un antígeno específico de P. falciparum (HRP-2 o proteína rica en histidina 2, producida en grandes cantidades sólo por P. falciparum) y otro antígeno común a todas las especies de Plasmodium (la enzima pan-LDH o aldolasa), con una banda para cada uno de estos antígenos. La positividad de las dos bandas (HRP-2 y pan-LDH) indica infección por P. falciparum sin poder excluir la infección mixta con otras especies. Una única banda a nivel de la pan-LDH descarta infección por P. falciparum y la malaria será debida a otras especies de Plasmodium. También hay tests que detectan una enzima LDH específica de P. falciparum (la enzima P. f-pLDH) y otra enzima específica de P. vivax (P.v-pLDH). En cualquier caso, será necesario una realizar una técnica de microscopía por gota gruesa y extensión fina o frotis para identificar la especie o especies infectantes y para calcular la parasitemia.2
La sensibilidad varía en función de la especie y del grado de parasitemia (sensibilidad más baja con parasitemias < 100 parásitos/μL, aunque también se han descrito falsos negativos con parasitemias muy elevadas por el fenómeno de prozona). En cuanto a la especie, las mejores cifras de sensibilidad se han descrito para P. falciparum (93,5-96,2%), son menores para P. vivax (77,4-97,2%) y muy variables para el resto de especies: P. ovale (5,5-86,7%) y P. malariae (21,4-45,2%). Para P. knowlesi. hay muy pocos estudios que evalúen su utilidad.2
Como inconvenientes hay que señalar que, en este tipo de pruebas, un resultado negativo no descarta una malaria, fundamentalmente si es debida a una especie distinta a P. falciparum. y que se han descrito falsos positivos en presencia de factor reumatoide y anticuerpos heterófilos. Además, también se han descrito casos aislados de falsos positivos con dengue, toxoplasma, virus de la hepatitis C, tuberculosis y otros parásitos (tripanosomiasis, Schistosoma spp., Leishmania spp.), principalmente con los anticuerpos monoclonales frente a HRP-2.1,2
En mujeres embarazadas, debido al secuestro de los parásitos en la placenta, la sensibilidad de la detección de antígeno puede estar disminuida.2
Estos tests no son útiles para el seguimiento post-tratamiento, puesto que, aunque la pan-LDH o aldolasa se negativiza tras el tratamiento, la proteína específica de P. falciparum puede persistir positiva varias semanas (35 días de media) después del tratamiento. Por este motivo sí que pueden ser útiles para confirmar un diagnóstico retrospectivo de una persona ya tratada previamente.2
La principales ventajas de estas técnicas de detección de antígenos es que son tests fáciles de realizar, rápidos, reproducibles y no requieren microscopio ni entrenamiento específico, pero que deben completarse siempre con una técnica de microscopía por gota gruesa y extensión fina o frotis.2
En nuestro centro de trabajo, se emplea el kit BinaxNOW® Malaria (Alere). Este test detecta, en formato de tarjeta, la HRP-2 y aldolasa en líneas diferentes, diferenciando por tanto si la infección es por P. falciparum (la especie más virulenta) o si es por una especie no-falciparum. Para la detección de P. falciparum la sensibilidad analítica es del 95,3% y la especificidad del 94,2%.,7,8
Técnicas de biología molecular para el diagnóstico de malaria:
La PCR múltiple en tiempo real es una prueba diagnóstica in vitro de biología molecular, basada en tecnología de amplificación de ADN específico de Plasmodium spp. Se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de secuencias diana específicas y su posterior detección con sondas también específicas. 9
Esta técnica de PCR múltiple permite la detección simultánea del DNA genómico de las distintas especies del género Plasmodium.1
Previo al proceso de amplificación se debe de realizar una extracción del material genómico de la muestra. 1,9.La técnica incluye un sistema de control interno para identificar la posible inhibición de la PCR y confirmar la integridad de los reactivos.9
Existen técnicas de PCR múltiple a tiempo real específicas de especie que detectan parasitemias muy bajas (desde 5 parásitos/µl hasta parasitemias tan bajas como 0,01 parásitos/µl) con una sensibilidad y especificidad cercanas al 100%.2,9
Para realizar la PCR a tiempo real para la detección del ADN de las especies de Plasmodium, se utiliza como muestra sangre venosa anticoagulada con EDTA, aunque también es aceptable muestra anticoagulada con citrato pero no con heparina ya que esta última puede interferir en la PCR.9
La técnica de PCR a tiempo real consta de dos procesos independientes:
– Extracción del material genómico de la muestra.
-Amplificación y detección en el extracto anteriormente obtenido. 9
Estas técnicas de PCR a tiempo real son de gran utilidad principalmente para la confirmación de especie, para el diagnóstico de infecciones mixtas y para el diagnóstico de infecciones submicroscópicas en pacientes inmunocompetentes. Además, La PCR a tiempo real es la única técnica diagnóstica útil para la detección de P. knowlesi, ya que esta especie es muy difícil de distinguir microscópicamente de P. malariae o P. falciparum. Además, puede ser útil para estudio de genes de resistencia de las especies de Plasmodium.2,9
Sin embargo, como desventaja hay que señalar que no distinguen entre parásitos viables y no viables, ni tampoco permiten evaluar el estadio en el que se encuentran los parásitos. Además, son técnicas más caras y generalmente su tiempo de respuesta es mayor.2,9
Otra desventaja importante es que la técnica de PCR a tiempo real es muy sensible y la presencia de inhibidores en la muestra puede causar falsos negativos o resultados inválidos. Además, la existencia de mutaciones en las regiones diana de los iniciadores y sondas puede causar también falsos negativos.9
Técnicas serológicas para el diagnóstico de malaria:
Existen diferentes técnicas serológicas disponibles que se usan sobre todo para fines epidemiológicos o en bancos de sangre para la detección de donantes infectados con bajas parasitemias. También se utilizan como criterio diagnóstico para la esplenomegalia malárica hiperreactiva.2
Debido a que estas técnicas pueden dar un resultado positivo hasta incluso un año después de completar el tratamiento antiparasitario, no son útiles para el diagnóstico de un caso agudo de malaria.2
Además, en estas técnicas se pueden dar reacciones cruzadas con Babesia spp.2
La más usada tradicionalmente es la Inmunofluorescencia Indirecta (IFA), pero debido a su subjetividad está siendo reemplazada por técnicas de ELISA.2
CONCLUSIONES
La malaria, o paludismo, es una enfermedad causada por parásitos del género Plasmodium que se transmite por la picadura de la hembra del mosquito Anopheles.
Aunque existen cinco especies de Plasmodium que causan malaria en el ser humano P. falciparum es la especie causante de los casos clínicos más graves y por este motivo es tan importante la diferenciación a nivel de especie en el diagnóstico microbiológico.
El diagnóstico de malaria, debido a que es una enfermedad potencialmente mortal en cuestión de horas, se debe realizar de forma urgente en el laboratorio de Microbiología, a través de microscopía (gota gruesa y extensión fina o frotis), pruebas rápidas de detección de antígenos, técnicas de biología molecular (PCR en tiempo real) y pruebas serológicas en determinados casos concretos.
La muestra de elección para realizar el diagnóstico de malaria en el laboratorio de Microbiología es sangre venosa anticoagulada con EDTA (tubo de tape malva), ya que el mismo tubo sirve para realizar las técnicas de gota gruesa, extensión fina o frotis, pruebas rápidas de detección de antígenos y PCR.
Las técnicas de microscopía (por gota gruesa y extensión fina o frotis) son las que actualmente se consideran gold estándar para el diagnóstico de malaria, ya que sirven para identificar la especie o especies infectantes y para calcular la parasitemia.
Las técnicas rápidas de detección de antígenos son útiles como apoyo a las técnicas de microscopía y principalmente se usan en el laboratorio de Microbiología como prueba de cribado para distinguir entre infección por P. falciparum (la especie más virulenta) o infección por especies de Plasmodium no- falciparum que son menos virulentas.
Las técnicas de biología molecular están ganando terreno como posible nuevo gold standard para el diagnóstico de malaria, ya que tienen la ventaja de detectar parasitemias muy bajas con una sensibilidad y especificidad muy elevadas. Además, son especialmente útiles para la confirmación de especie, para el diagnóstico de infecciones mixtas y constituyen la única técnica existente para la detección de P. knowlesi. Por el momento, esta técnica está restringida a la validación de los resultados de la microscopía o de la detección antigénica. Por otro lado, como la PCR a tiempo real, es una técnica potencialmente cuantitativa, puede emplearse para controlar la eficacia del tratamiento y pueden usarse para estimar las resistencias a los tratamientos antipalúdicos.
Las técnicas serológicas solo se usan como métodos diagnósticos en casos concretos (diagnóstico de esplenomegalia malárica hiperreactiva) y sobre todo a nivel epidemiológico o en bancos de sangre.
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