La proteína STAT como biomarcador pronóstico-diagnóstico del desarrollo del Síndrome Sjögren. Planteamiento de un proyecto de investigación

AUTORES

1. Jara Villar Carruesco. Enfermera en la Unidad de Cardiología Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.
2. Ana Luño Casabona. Enfermera en Radiología Intervencionista Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza.
3. Belén Alba Delgado. Enfermera en la Unidad de Digestivo Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.
4. Silvia Gallego Matossi. Enfermera en la Unidad de Urología Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza.
5. Ana Gracia Lázaro. Enfermera en Pediatría B Hospital Materno Infantil Hospital Miguel Servet, Zaragoza.
6. Raquel Oter Gimeno. Enfermera en la Unidad de Ictus – Neurología Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza.

 

RESUMEN

El Síndrome de Sjögren es una enfermedad autoinmune sistémica y crónica que disminuye considerablemente la calidad de vida conforme va progresando. Aunque el porcentaje total de afectados con el Síndrome de Sjögren en la población general es de hasta el 3%, es decir, una mínima parte de la población es necesario un diagnóstico diferencial precoz para poder abordarlo lo antes posible.

Este estudio intenta determinar un biomarcador pronóstico-diagnóstico del Síndrome de Sjögren mediante una prueba complementaria como es una analítica de sangre. Por ello, se realizará un estudio epidemiológico observacional analítico prospectivo de tres años. Será un estudio de casos y controles llevado a cabo en la Unidad de Enfermedades Autoinmunes Sistémicas (UEAS) de las consultas externas del Hospital Universitario Miguel Servet (HUMS). Se diferenciarán dos grupos según vaya progresando o no la enfermedad para predeterminar unos valores específicos inherentes.

Si existe relación entre los signos y síntomas que se describen como criterios para el diagnóstico del Síndrome de Sjögren (ESSPRI) y los valores de la expresión de la proteína STAT en suero, la proteína STAT podría ser una solución para el pronóstico-diagnóstico de esta enfermedad.

PALABRAS CLAVE

Índice de pacientes informados del síndrome de Eular Sjögren (ESSPRI), activador de la transcripción y transductor de la señal (STAT), biomarcadores.

ABSTRACT

Sjögren Syndrome is a chronic, systemic disorder of an autoinmune nature that sygnificantly decrease quality of life as it keeps in progress. Although the total percentage affected with Syndrome Sjögren in the general population is up to 3%, that is a small part of the population, an early differential diagnosis is necessary to be able to address it as soon as possible.

This study attempts to determine a prognostic-diagnostic biomarker of Sjögren’s Syndrome through a complementary test such as a blood test. Therefore, a three-year prospective analytical observational epidemiological study will be conducted. It will be a case-control study carried out in the Systemic Autoinmune Diseases Unit (UEAS) of the outpatient clinics of the Miguel Servet Universitary Hospital (HUMS). Two groups will be differentiated as the disease goes on or not to predetermine specific inherent values.

If there is a relationship between the signs and symptoms described as criteria for the Sjögren syndrome diagnosis (ESSPRI) and the values of the expression of the STAT protein in serum, STAT protein could be a solution for the prognosis-diagnosis of this disorder.

KEY WORDS

Eular Sjögren’s Syndrome Patient Reported Index (ESSPRI), signal transducer and activator of transcription (STAT).

INTRODUCCIÓN

El síndrome de Sjögren es una enfermedad autoinmune sistémica que afecta de manera progresiva e insidiosa a las glándulas exocrinas. Esto lleva a la sequedad de mucosas, principalmente boca y ojos, y si no se trata, tiempo después, a la afectación de diferentes órganos del cuerpo¹. Es por ello que se considera una enfermedad sistémica.

Es una enfermedad autoinmune ya que el sistema inmunitario del cuerpo genera defensas ante su propio organismo como agente externo. Así se crean los autoanticuerpos que provocan lesiones en las glándulas.

Existen dos tipos del Síndrome de Sjögren: el primario y el secundario. El primario se caracteriza por ser una enfermedad que ocurre por sí sola, no es causa de otras enfermedades, es el elemento principal. El Síndrome de Sjögren secundario es aquel que se presenta con otras enfermedades autoinmunes como el lupus, la miositis o la artritis reumatoide.

Esta enfermedad afecta a personas de cualquier raza y edad. Aunque el 90% de las personas afectadas son mujeres de mediana edad, normalmente a partir de los 40 años². Además, tiene un factor hereditario que ejerce una mayor probabilidad de padecerlo de madres a hijas³.

A la hora de diagnosticar el Síndrome de Sjögren, el médico responsable tiene que hacer una buena valoración, ya que es muy difícil decidir el diagnóstico mediante la clínica, la cual es muy generalizada e individualizada. Es decir, son signos y síntomas muy comunes, pero que se manifiestan diferente en cada persona. Para ello, además de una primera anamnesis, se realizan tres pruebas médicas principales: una prueba oftalmológica, un análisis de sangre y una gammagrafía.

El análisis de sangre sirve principalmente para detectar la presencia de autoanticuerpos. En el Síndrome de Sjögren aparecen unos anticuerpos con una elevada frecuencia que se llaman SS-A (conocidos como anti Ro) y SS-B (llamados también anti La). También suelen aparecer los anticuerpos antinucleares (AAN) y el factor reumatoide (FR). Pero no tienen un marcador biológico característico y único.

Además del análisis, también se utiliza la prueba de Schirmer, la cual mide la producción de lágrimas. Consiste en colocar una tira pequeña de papel bajo el párpado inferior para determinar la cantidad de lágrimas que producen las glándulas lacrimales.

Para poder diagnosticar la enfermedad, el médico se apoya en los criterios clasificatorios de EULAR⁴.

Hasta el momento no se ha conseguido hallar un biomarcador específico que informe de la presencia del Síndrome Sjögren antes de que los síntomas aparezcan. En la actualidad, afecta entre 0’2 al 3% de la población general⁵. Esto nos lleva a investigar la presencia de biomarcadores que ayuden a diagnosticar la enfermedad. Uno de los estudios más interesantes llevados a cabo fue el de M Pertovaara et al. En ese estudio se investigó la presencia de proteínas con STAT (un marcador activador de la transcripción y transductor de la señal), aunque aún queda mucho por descubrir. Este marcador aparece considerablemente aumentado en personas con síndrome de Sjögren primario⁶.

Hasta ahora, el tratamiento para esta patología se basa en los síntomas del paciente y en el compromiso de salud que genere. Para ello, se utilizan medidas generales para evitar la sequedad de ojos, estimulantes para la secreción y otras medicaciones para situaciones más graves que ocasionen un gran peligro para la vida. Varios estudios abalan el buen funcionamiento y seguridad del Rituximab y del Epratuzumab^5-7-8.

A la hora de llevar a cabo un examen específico para diagnosticar la enfermedad del Síndrome Sjögren existen varios estudios en proceso que intentan ser lo menos agresivos posible. Hay estudios como los de YS Byun et al., DM Rassi et al. y SV Aluru et al. que estudian diagnosticar la enfermedad mediante biomarcadores lacrimales. Así como con biomarcadores salivares^9-10.

Por otro lado, está el tratamiento pautado para este diagnóstico. Puede tratarse de tratamiento directo para la enfermedad o secundario para aliviar efectos y síntomas que produce el Síndrome Sjögren. Para ello se usan todo tipo de fármacos: analgésicos, corticoides, etc.

JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA

Como ya se ha mencionado anteriormente, diagnosticar el Síndrome de Sjögren es complicado. Se requieren muchos datos que no se conocen y no tiene una clínica clara que lo relacione. Además, se hace uso de recursos y procesos más prolongados y económicamente más elevados que no obtienen un resultado específico.

Por este motivo, se investiga un biomarcador que pueda encontrarse en sangre y pueda ser identificativo para diagnosticar el Síndrome de Sjögren. De esta forma se podría realizar un control preventivo para abordar la enfermedad con antelación y mejorar la calidad de vida del paciente. Asimismo, el gasto económico disminuiría considerablemente gracias a la realización de una única prueba complementaria como es la analítica de sangre. Sería un recurso rápido, más simple y no invasivo.

Los marcadores estudiados hasta el momento no han supuesto una mejora de precisión en los sistemas de diagnóstico actuales, ninguno ha sido puesto en marcha a la hora de diagnosticar ni se ha llevado a la práctica habitual.

Hipótesis:

Existe una correlación directamente relacionada entre los parámetros clínicos descritos en el Síndrome Sjögren (ESSPRI) y la expresión de la proteína STAT en patologías autoinmunes sistémicas. Esta proteína nos sirve como biomarcador pronóstico diagnóstico de la enfermedad.

OBJETIVOS

Principales:

• Determinar la correlación entre ESSPRI y biomarcadores específicos como la proteína STAT.
• Determinar los niveles de la proteína STAT en suero de pacientes con Síndrome de Sjögren, ver su variación y evolución en el tiempo según lo desarrollen o no.

 

Secundarios:

• Analizar si existe correlación entre ESSPRI y la expresión de la proteína STAT para determinar como biomarcador pronóstico-diagnóstico del Síndrome Sjögren.
• Identificar la relación entre valores de STAT y otros valores identificados en las enfermedades autoinmunes.
• Investigar la relación entre STAT1, STAT3 y STAT5 con el Síndrome Sjögren.

 

METODOLOGÍA

Diseño de estudio:

Se llevará a cabo un estudio epidemiológico observacional analítico prospectivo. Será un estudio de casos y controles, es decir, se distinguirán dos grupos en el proceso de 3 años: aquellos que sean diagnosticados con la enfermedad y aquellos que no lo sean. Para ello, se evaluará la presencia de proteínas con STAT en sangre. Este procedimiento es relativamente fácil de realizar y poco costoso respecto a la realización de otras pruebas complementarias.

Sujetos de estudio:

La población de estudio serán hombres y mujeres asociados a las consultas de la Unidad de Enfermedades Autoinmunes Sistémicas (UEAS) del Hospital Universitario Miguel Servet (HUMS) que tengan firmado el consentimiento informado y quieran participar.

Se deben añadir varios criterios de inclusión para determinar la selección de la muestra:

• Tener más de 18 años.
• Aceptar el consentimiento informado y presentarlo firmado.

 

Así como criterios de exclusión:

• No tener movilidad adecuada para los traslados a consultas.
• Estar contraindicada la intervención por el médico facultativo responsable del paciente.

 

Determinar el tamaño de la muestra que se va a seleccionar es un paso muy importante en cualquier estudio de investigación. Por ello, necesitamos determinar el tamaño de la población, el margen de error, el intervalo de confianza y la desviación estándar.

El cálculo del tamaño de la muestra es el siguiente:

n = —————————————

En el que n = tamaño de la muestra; N = población; Z = nivel de confianza (97%); e = margen de error (3%); y p = 50%.

Recogida y análisis de información:

El estudio se realizará con pacientes mayores de 18 años que acudan a las consultas externas de la Unidad de Enfermedades Autoinmunes Sistémicas del Hospital Universitario Miguel Servet. Se les realizará una analítica de sangre buscando la proteína con STAT y su valor para identificar si puede ser un biomarcador específico de la enfermedad del Síndrome Sjögren. Se observará su evolución. Este procedimiento se llevará a cabo cada 6 meses durante 3 años para realizar un seguimiento minucioso de los valores STAT1, STAT3 y STAT5. También se tendrán en cuenta otros biomarcadores como la proteína C reactiva (PCR), la velocidad de sedimentación glomerular (VSG), las plaquetas, la inmunoglubulina G (Igg), los complementos de la sangre (C3 y C4) y el factor reumatoide (FR). Así como los anticuerpos anti Ro, los anticuerpos anti La y los anticuerpos antinucleares (AAN).

Análisis de los datos:

El estudio se realizará con pacientes mayores de 18 años que acudan a la UEAS del servicio de consultas externas del HUMS.

Los participantes en el estudio deberán firmar un consentimiento informado autorizando la recogida de datos. Para llegar al objetivo de utilizar una analítica de sangre como prueba pronóstica y diagnóstica del Síndrome Sjögren se realizarán un total de 6 extracciones de sangre a lo largo de 3 años, una cada 6 meses. Se extraerán dos tubos de sangre por extracción: el tubo de heparina litio (tubo de hemograma) y el tubo de suero seco (tubo de bioquímica).

La muestra se obtendrá mediante punción endovenosa de una muestra de sangre periférica de los pacientes.

• En el caso de la obtención de la porción sérica, la muestra se procesa dentro de las primeras 24 horas tras la extracción, realizándose para la recogida del suero centrifugado a 3000 rpm durante 10 minutos. Se recoge entonces la parte sérica por decantación y se congela a -‐20ºC hasta analizar dichos sueros en placa de Elisa.
• En el caso del procesado de la muestra para la determinación de la expresión de la proteína STAT (1,3,5) mediante citometría de Flujo (FACS), la determinación de STAT(1,3,5) en el suero de los pacientes se realiza de manera automática en un aparato del modelo Quantalyser 160 de la marca Werfen. Se utiliza un test comercial para detección de STAT1, 3 y 5 (Elisa kits – biocompare.com).

 

El tubo de heparina litio se usará con la prueba FACS, citometría de flujo. Es una técnica que permite medir simultáneamente múltiples características ópticas (fluorescencia y dispersión de luz) de cada una de las células presentes en una suspensión.

El citómetro permite el paso de las células una a una, sobre las que incide un láser y mide la absorción (FSC, relacionada con el tamaño celular), la dispersión lateral (SSC, relacionada con la complejidad celular) y la emisión de fluorescencia.

Mediante esta técnica se estudiará la presencia de la proteína STAT (1,3 y 5) usando una selección de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos.

Un fluorocromo absorbe la energía de la luz incidente (láser) en un rango de longitudes de onda característico para ese compuesto, se excita, y de manera prácticamente instantánea disipa la energía absorbida como vibración y generación de calor, emitiendo un fotón de mayor longitud de onda (menos energético). Esta transición de energía se denomina fluorescencia.

Por otro lado, el tubo de bioquímica se utilizará para realizar el Test Elisa. Se trata de un ELISA en sándwich en el que las muestras y los estándares se incuban en una placa de 96 pocillos con el anticuerpo primario contra la molécula que queremos detectar, es decir, contra la STAT, en presencia de un anticuerpo secundario marcado. Tras la incubación se lavan los pocillos y la actividad enzimática se detecta con la adición de un sustrato cromogénico. La intensidad de la coloración es proporcional a la concentración de la molécula en la muestra a estudio.

Inicialmente, se realizará un estudio descriptivo de los datos obtenidos desde el punto de vista numérico y gráfico para partir de los valores base en sangre.

En segundo lugar se realizará un análisis inferencial entre los resultados obtenidos sobre expresión de STAT y los diferentes factores pronósticos individualizados.

Se realizará la prueba t de student para comparar los resultados en hombres y mujeres. Así como para comparar los valores obtenidos en las diferentes analíticas que se lleven a cabo.

Tras la realización de las diferentes tareas los resultados obtenidos serán estudiados y analizados mediante el paquete estadístico PASW Statistic v.24.0.0 (SPSS Inc.).  Para considerar un resultado estadísticamente significativo, se considerará una p < 0,05.

LIMITACIONES

En un estudio prospectivo, la posibilidad de la pérdida de datos es casi inevitable. Puede haber sujetos de la población seleccionada que dejen de acudir a consulta o que fallezcan. Esto conlleva una pérdida de la información. Para ello, se selecciona una muestra mayor, así prevenimos las pérdidas que puedan surgir.

Por otro lado, el estudio hace uso del juicio clínico del médico para definir el diagnóstico de la enfermedad ya que no consta de ningún indicador específico.

ASPECTOS ÉTICOS

A todos los pacientes se les entregará un consentimiento informado en el que le explique todo el procedimiento a realizar. Así como la garantía de la privacidad de los datos.

También se aplicarán las leyes que se ajusten al estudio con las que se rige el Comité Ético de Investigación Clínica de Aragón (CEICA), que son las siguientes:

• Ley 14/2007 de Investigación Biomédica.
• Decreto 26/2003 de 14 de febrero, del Gobierno de Aragón.
• Decreto 292/2005, de 13 de diciembre de 2005, del Gobierno de Aragón.
• Orden de 1 de diciembre de 2003, del Departamento de Salud y Consumo.

 

Por supuesto, el estudio se llevará a cabo teniendo en cuenta los cuatro principios éticos de enfermería: la autonomía de los participantes, la beneficencia, la no maleficencia y la justicia. Así como el apoyo a la Declaración de Helsinki de la Asamblea Médica Mundial que habla de los principios éticos que se deben postular a la hora de realizar un estudio.

PLAN DE TRABAJO

El proyecto se realizaría en 3 años desde el inicio del proyecto. Previamente reuniríamos a un equipo de investigación para tratar e informar los temas necesarios para la realización del proyecto. Una vez informados, solicitaríamos la aprobación del CEICA para poder plasmar el proyecto en la realidad.

A partir de ahí:

• El primer año realizaríamos diversas reuniones entre los investigadores para tratar los avances, cumplimentar la base de datos, realizar la búsqueda bibliográfica, realizar la recogida de datos y la recogida y procesado de muestras para su posterior análisis e interpretación.
• El segundo año continuaríamos con la recogida y procesado de muestras. Luego, analizaríamos y procesaríamos las muestras.
• El tercer año terminaríamos con el análisis e interpretación de resultados y redactaríamos el informe final. En ese momento nos plantearíamos la realización de un artículo para divulgar los resultados obtenidos.

CONCLUSIONES

El objetivo principal es encontrar un biomarcador que, junto a unos valores coincidentes a los marcadores comunes, sea específico para diagnosticar el Síndrome de Sjögren. Así, poder detectar y tratar precozmente la enfermedad sin llegar a estadios más avanzados y garantizar una mejor calidad de vida al paciente.

Se pretende considerar una combinación de marcadores específicos junto a la proteína con STAT para poder realizar un diagnóstico diferencial del Síndrome Sjögren. Para ello investigaremos las tres presentaciones de la proteína ligadas al sistema inmunitario (STAT1, STAT3, STAT5).

Gracias a este estudio prospectivo, se podrá investigar sobre los valores que se obtienen en los marcadores descritos anteriormente a lo largo de los 3 años y considerar su evolución mediante una analítica de sangre.

Se realizan las dos técnicas (FACs y ELISA) para determinar si se pueden extrapolar los datos de la microbiología a los valores numéricos de una analítica de sangre. Si los valores determinados en una prueba son coincidentes con los valores que se extraen de una muestra sérica, esto conllevaría una mayor facilidad a la hora de encontrar resultados. Así como una mejora en el gasto económico del centro.

Respecto a las teorías que se han tenido en cuenta a la hora de diagnosticar la enfermedad a través de marcadores de las células lacrimales, aunque es cierto que no son nada agresivas para el paciente, es verdad que si uno de los síntomas que ocasiona el Síndrome Sjögren es sequedad de las mucosas, no es conveniente realizar una pruebas que necesite lágrimas. En cuanto a marcadores salivares, tendríamos el mismo problema. Por lo cual, se cree ventajoso el uso de un biomarcador en sangre.

Si STAT llegará a ser un biomarcador fiable de diagnóstico y pronóstico de la enfermedad del Síndrome Sjögren, se podría implementar una prueba preventiva de esta enfermedad como respuesta a un problema de salud pública. Si fuera así, el primer análisis debería ser a partir de los 40 años, ya que es el rango de edad en el que suele aparecer la enfermedad.

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