Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tipos y usos

AUTORES

1. Carlos Galindo Lalana. Biotecnólogo. Máster Universitario en Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza. España.
2. Elena Galindo Lalana. MIR 4º año Pediatría Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa” Zaragoza. España.

RESUMEN

La reacción en cadena de la polimerasa, abreviada PCR por su nombre en inglés (Polymerase Chain Reaction) se ha popularizado en el lenguaje coloquial a raíz de la pandemia de COVID-19, pero su uso en laboratorio es muy habitual desde hace muchos años. Esta técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consiste en la replicación in vitro de un fragmento de ADN específico. Para realizar la técnica será necesario conocer, al menos en parte, la secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen o una región de ADN). La técnica replicará el fragmento de ADN para conseguir realizar in vitro lo que las células hacen in vivo para replicar su ADN.

La PCR permite “amplificar” o “fotocopiar” diminutos segmentos de ADN millones de veces de manera que luego se pueda demostrar su presencia con facilidad. Se puede contemplar esta técnica como uno de los avances científicos más importantes en biología molecular, que valió a su creador, Kary B. Mullis, el Premio Nobel de Química en 1993.

Sus usos son múltiples y van desde la secuenciación del ADN hasta la generación de perfiles de ADN forense a partir de muestras genéticas, pasando por la identificación de patógenos gracias a la detección de la ausencia o presencia de sus genes.

PALABRAS CLAVE

Reacción en cadena de la polimerasa, diagnóstico molecular, amplificación ADN, test COVID-19

ABSTRACT

The polymerase chain reaction, abbreviated PCR by its English name (Polymerase Chain Reaction), has become popular in colloquial language because of the COVID-19 pandemic, but its use in the laboratory has been very common for many years. This DNA amplification technique using the polymerase chain reaction (PCR) consists of the in vitro replication of a specific DNA fragment. To perform the technique it will be necessary to know, at least in part, the sequence of the fragment to be amplified (a gene, a part of a gene or a region of DNA). The technique will replicate the DNA fragment to achieve in vitro what cells do in vivo to replicate their DNA.

PCR allows tiny segments of DNA to be “amplified” or “photocopied” millions of times so that their presence can then be easily demonstrated. This technique can be seen as one of the most important scientific advances in molecular biology, which earned its creator, Kary B. Mullis, the Nobel Prize in Chemistry in 1993.

Its uses are multiple and range from DNA sequencing to the generation of forensic DNA profiles from genetic samples, including the identification of pathogens thanks to the detection of the absence or presence of their genes.

KEY WORDS

Polymerase chain reaction, molecular diagnosis, ADN amplification, COVID-19 testing.

INTRODUCCIÓN

Dos años después del estallido de la pandemia en España se habían realizado más de 62 millones de PCR¹. Se trata de una cifra sin precedentes para esta técnica de laboratorio que ha sido crucial tras la aparición del coronavirus. Sin embargo, esta prueba no es nueva. Por el contrario, lleva utilizándose más de 30 años y en los últimos 20 se ha convertido en una técnica básica en los laboratorios de microbiología.

Poe explicarlo de forma sencilla, la PCR es una actividad enzimática que imita lo que las células de nuestro organismo hacen de forma natural por acción de las ADN polimerasas, que pueden obtener dos copias idénticas de las cadenas de ADN nuclear. Posteriormente durante la mitosis las repartirán a sus células hijas. De este modo, en esta técnica las polimerasas (generalmente las denominadas Taq), podrán replicar, como una fotocopiadora, un fragmento de ADN en varios ciclos (entre 20 y 35) con cambios repetidos de temperatura. Así se conseguirán una gran cantidad de copias que se podrán analizar en una reacción en cadena que es lo que da el nombre a la técnica.

En 1983 el Dr. Kary Mullis presentó la PCR como método para copiar ADN y sintetizar grandes cantidades de un ADN objetivo específico. Por los descubrimientos asociados al desarrollo de esta técnica recibió el premio Nobel de Química en 1993.

Hoy en día, la PCR se considera uno de los avances científicos más importantes del siglo pasado. De forma rápida y sencilla se pueden crear copias ilimitadas de ADN a partir de una sola hebra original. En solo unas horas se obtienen millones de copias de una sección de ADN. El ADN copiado puede usarse de manera fiable en una gran variedad de pruebas para diagnosticar y monitorizar enfermedades o para investigación de biología molecular básica.

Al método de la PCR ideado por el Dr Mullis, se añadieron 2 avances importantes que han permitido que la PCR se convierta en la tecnología actual: la polimerasa Taq y el ciclador térmico. La polimerasa Taq se aisló a partir de la bacteria Thermus aquaticus. Su competencia más importante es que puede llegar a soportar altas temperaturas. Otras polimerasas se degradaban por el calor y a lo largo del proceso era necesario sustituirlas de forma manual. Cuando ya no fue necesaria la intervención humana durante este paso, se acortó y facilitó todo el proceso. En 1987 se aplicó por primera vez un ciclador térmico, que es un instrumento programado para regular la temperatura de una reacción, de tal forma que calienta o enfría las muestras según sea necesario. De nuevo, este adelanto minimizó la intervención humana en la reacción, lo que da lugar a un proceso aséptico, eficaz y fácil de realizar.

La utilización de PCR ha permitido multitud de avances científicos como²:

• Identificar posibles sospechosos o exculpar a implicados cuyo ADN puede corresponderse con pruebas de la escena de un crimen.
• Detectar errores genéticos en personas afectadas de enfermedades.
• Identificar víctimas de crímenes y catástrofes.
• Establecer relaciones de paternidad y otras relaciones familiares.
• Identificar especies en peligro y protegidas, pedigrí de semillas o crías de ganado.
• Diagnosticar patógenos en múltiples enfermedades infecciosas, tanto en humanos como en animales.
• Detectar bacterias y otros microorganismos que pueden contaminar el aire, el agua, la tierra y los alimentos.
• Relacionar donantes de órganos con receptores de programas de trasplantes.

USOS DE LA PCR EN EL CAMPO DE LA MEDICINA:

De manera general se puede decir que el Genoma Humano se ha conseguido gracias a la PCR.

Son muchas las técnicas clínicas y de laboratorio en las que se aplica la PCR para la detección de microorganismos habiendo sustituido a otras más antiguas. Se realiza de forma rápida y sencilla, con alta sensibilidad y especificidad, ya que permite detectar pequeños fragmentos de ADN del patógeno implicado.

La adaptabilidad de la PCR ha servido para su aplicación en diversas áreas de la investigación y la medicina. Entre estas las más importantes:

1. Diagnóstico de Enfermedades Genéticas: El PCR permite detectar mutaciones genéticas asociadas con enfermedades hereditarias, permitiendo diagnósticos tempranos y precisos.
2. Identificación de Patógenos: En el ámbito médico, la PCR se utiliza para detectar el ADN de bacterias, virus o parásitos en muestras a partir de suero o tejidos extraídos de un paciente. Se reproducen regiones específicas del ADN patógeno encontradas en las muestras, demostrando así la presencia del patógeno^3,4.
3. Investigación en Biología Molecular: En el laboratorio se ha convertido en una prueba imprescindible para la clonación de genes, la secuenciación de ADN y la creación de bibliotecas genómicas.
4. Perfil de ADN y Criminalística: la PCR se emplea para analizar perfiles de ADN, facilitando la identificación de individuos en investigaciones forenses y en estudios paleontologicos⁵.

MATERIAL NECESARIO:

• Fragmento de ADN que se quiera copiar. Se debe extraer purificado de la muestra de sangre u otro tejido. Sin la presencia de un fragmento de ADN el resultado de la PCR será negativo.
• Taq polimerasa y nucleótidos (bloques básicos de ADN para realizar las copias).
• Cebadores o iniciadores (primers en inglés). Son oligonucleótidos monocatenarios que unidos al ADN en sus extremos hacen que la polimerasa inicie la reacción de duplicación del ADN.
• Además de estos materiales, la PCR implica un proceso de cambios de temperatura (los ciclos) que se realizan en un equipo llamado termociclador, programado para alterar la temperatura de la reacción cada pocos minutos y dar lugar a la desnaturalización y síntesis del ADN, teniendo el resultado en unas pocas horas.

ETAPAS DE LA PCR (Fig. 1):

1. Primera etapa: Desnaturalización (96ºC): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Así se obtienen los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso. Las altas temperaturas alcanzadas hacen que los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas molde de ADN se rompan y las dos cadenas se separen. Una vez separadas sirven para hacer las copias. La duración de esta etapa es de unos 15-30 segundos.
2. Segunda etapa: Templado y alineación del ADN (55 -65ºC): en este paso hay que enfriar la reacción para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla. Estos cebadores se deben colocar en cada extremo de la secuencia a copiar. Son secuencias de ADN con 20-30 bases de longitud que complementan secciones cortas del ADN en los extremos. Permiten marcar el lugar inicial para empezar a sintetizar el ADN y que las polimerasas vayan duplicando la hebra sencilla añadiendo bases de ADN. Así, la polimerasa genera una nueva hebra complementaria a partir de bases sueltas. Como las dos hebras del molde de ADN son complementarias y cada una va en sentido opuesto, son necesarios dos cebadores, uno a cada lado (uno directo y uno inverso). Este paso suele tardar entre 10-30 segundos.
3. Tercera etapa: Extensión/Amplificación (72ºC): de nuevo se necesita elevar la temperatura para que la Taq polimerasa extiende los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN. La polimerasa Taq construye una hebra complementaria, se adhiere al cebador inicial y luego agrega bases de ADN a la hebra individual para fabricar una nueva cadena doble de ADN. Copiar unas 1000 bases de ADN puede costar 1 minuto.

REPETICIONES:

Tras completar el proceso se deben repetir estos tres pasos de 20 a 40 veces, dando lugar a un número exponencial de copias cada vez. Esto se debe a que los nuevos fragmentos de ADN generados funcionan a su vez como plantillas a las que se une la polimerasa y generan nuevo ADN. De un solo segmento concreto de ADN se termina obteniendo un gran número de copias en muy poco tiempo. Cada vez se utilizan máquinas más potentes y técnicas más novedosas que pueden acortar los plazos de tiempo de manera importante⁶.

TIPOS DE PCR:

En todos estos años de uso de las técnicas de PCR en diferentes campos, han aparecido muchas variantes y mejoras de las técnicas empleadas. Cada una de ellas son utilizadas preferentemente según requisitos y objetivos necesarios. De todas ellas merecen destacar las siguientes:

PCR in situ:

Tiene la ventaja de poder detectar cadenas de ADN que se encuentran dentro de las células y que, por lo tanto, no se pueden identificar con otras técnicas . Se realiza directamente sobre tejidos. Como desventaja hay que señalar que tiene menor capacidad de amplificación⁷.

PRC de células viables:

Se realiza previamente una neutralización del material genético “libre” en la suspensión y que suele proceder de células dañadas o muertas. De esta manera el ADN que se encuentre corresponderá solamente a las células vivas presentes en nuestra muestra.

PCR anidada:

Está variación de la reacción en cadena de la polimerasa se usa cuando se quiere incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Consiste en duplicar el paso de la amplificación con distintos pares de primers (cebadores) en cada uno con el fin de aumentar la sensibilidad y la especificidad de la detección. En un primer paso se realiza una reacción en cadena con los cebadores externos para amplificar la parte más extensa de ADN, que contiene el segmento que tenemos por objetivo. Posteriormente esta amplificación se usa como ADN plantilla en la realización de una segunda PCR con cebadores internos y así copiar ese segmento específico⁸.

PCR múltiple:

La idea de esta técnica es utilizar varias parejas de cebadores en una misma reacción en cadena en varias ampliaciones. Se puede detectar una misma reacción de varios patógenos a la vez, al utilizar parejas de virus diferentes. Muy usado en grupos de virus respiratorios o en grupos de patógenos digestivos ⁹.

PCR cuantitativa o en tiempo real:

Es la más utilizada si lo que se desea testar es un microorganismo en alimentos muy perecederos o de vida útil corta. La ventaja principal de esta PCR es que permite monitorizar (medir) durante cada ciclo de amplificación y en tiempo real, la cantidad de fragmentos de material genético que se van produciendo sin necesidad de llegar al número total de amplificaciones. Esto supone un ahorro de tiempo y dinero sin mermar la calidad del resultado. Para llevarla a cabo se necesitan reactivos fluorescentes y un termociclador que mide la fluorescencia en cada ciclo de amplificación^10,11.

RT-PCR (con transcriptasa inversa):

Esta técnica de PCR es la indicada para virus que tienen genoma de ARN. En estos casos es imprescindible un paso previo en el proceso: ya que una vez aislado y purificado el ARN, se necesita la transcriptasa inversa (llamada RT, por sus siglas en inglés, Reverse Transcription) para sintetizar una molécula de ADN complementario que permita posteriormente iniciar la PCR convencional. Esta técnica fue utilizada durante la pandemia de COVID-19 causada por el virus SARS-CoV-2¹².

Consta, por lo tanto, de tres pasos:

•  Primer paso: retrotranscripción a partir del ARN.
•  Segundo paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
•  Tercero paso: PCR estándar.

PCR digital:

La estrategia para la PCR digital (dPCR) se ha resumido como «divide y vencerás»: una muestra se diluye y se divide en cientos o incluso millones de cámaras de reacción separadas para que cada una contenga una o ninguna copia de la secuencia de interés. Al contar el número de particiones «positivas» (en las que se detecta la secuencia) frente a particiones «negativas» (en las que no), los científicos pueden determinar exactamente cuántas copias de una molécula de ADN había en la muestra original. Cuantas más particiones mayores serán la especificidad y la sensibilidad. Entre sus aplicaciones se ha utilizado para detectar errores genéticos, para rastrear infecciones virales o para cuantificar genes cancerosos en muestras de pacientes¹³.

CONCLUSIÓN

Aunque la PCR lleva muchos años de desarrollo se ha dado a conocer al público general a partir de la pandemia. Al tratarse de una técnica fundamental en el diagnóstico molecular cada vez son más sus aplicaciones y con toda seguridad su aplicabilidad será cada vez mayor.

BIBLIOGRAFÍA

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ANEXOS