Emergencia de un subtipo hipertransmisible de Cryptosporidium hominis en España

AUTORES

1. María Ducóns Márquez. Servicio de Microbiología y Parasitología. Hospital de Alcañiz, Teruel, España.
2. Eugenia Mercedes Sanz Valer. Servicio de Medicina Interna. Hospital de Alcañiz, Teruel, España.
3. Laura Peiro Muntadas. Servicio de Medicina Interna. Hospital de Alcañiz, Teruel, España.
4. Ana Bolea Lacueva. Servicio de Farmacia. Hospital de Alcañiz, Teruel, España.
5. Víctor Acín Garcés. Servicio de Aparato Digestivo. Hospital de Alcañiz, Teruel, España.
6. Cristina Polo Cuadro. Servicio de Aparato Digestivo. Hospital de Alcañiz, Teruel, España.

RESUMEN

Introducción: Cryptosporidium hominis es un protozoo de transmisión fecal-oral responsable de brotes de gastroenteritis de origen hídrico. Su detección y caracterización molecular son esenciales para la vigilancia epidemiológica y el control de brotes.

Objetivo: Describir y caracterizar un brote de Cryptosporidium hominis mediante diagnóstico microbiológico utilizando técnicas moleculares.

Método: Se analizaron 138 muestras de heces de pacientes con síntomas gastrointestinales para detectar virus, bacterias y parásitos. Se emplearon diversas técnicas, entre ellas inmunocromatografía, examen microscópico y PCR en tiempo real, con el fin de determinar el género del microorganismo causante. Ante la sospecha de una fuente común de infección, se recogieron nueve muestras ambientales del río que abastece de agua a la zona de Tarazona. Posteriormente, un total de 34 muestras clínicas y cinco muestras ambientales fueron enviadas al Centro Nacional de Microbiología para la identificación de especie, familia y subtipo mediante PCR y secuenciación posterior.

Resultados: El análisis de virus y bacterias fue negativo. Cincuenta y tres muestras resultaron positivas para Cryptosporidium spp. mediante inmunocromatografía y microscopía, mientras que 85 fueron negativas. La PCR en tiempo real confirmó la positividad de las muestras y permitió identificar falsos negativos obtenidos mediante inmunocromatografía. Los resultados de las muestras clínicas y ambientales analizadas en el Centro Nacional de Microbiología fueron positivos para C. hominis, siendo el subtipo IfA12G1R5 el detectado con mayor frecuencia.

Conclusiones: Este brote representa uno de los mayores registrados en España y Europa. La PCR mostró mayor sensibilidad que las técnicas inmunocromatográficas, especialmente en cargas parasitarias bajas. La identificación de C. hominis y del subtipo IfA12G1R5 sugiere un origen humano y una posible expansión de este linaje. La vigilancia microbiológica activa, la notificación precoz y la colaboración multidisciplinar son esenciales para detectar, contener y caracterizar los brotes.

PALABRAS CLAVE

Cryptosporidium hominis, criptosporidiosis, brotes de enfermedad, enfermedades transmitidas por el agua, reacción en cadena de la polimerasa, epidemiología molecular.

ABSTRACT

Introduction: Cryptosporidium hominis is a protozoan parasite transmitted via the fecal–oral route and responsible for outbreaks of waterborne gastroenteritis. Its detection and molecular characterization are essential for epidemiological surveillance and outbreak control.

Objective: To describe and characterize an outbreak of Cryptosporidium hominis using microbiological diagnostic methods, including molecular techniques.

Method: A total of 138 stool samples from patients presenting with gastrointestinal symptoms were analyzed for the detection of viruses, bacteria, and parasites. Several diagnostic techniques were employed, including immunochromatographic assays, microscopic examination, and real-time PCR, to identify the genus of the causative microorganism. Given the suspicion of a common source of infection, nine environmental samples were collected from the river supplying water to the Tarazona area. Subsequently, 34 clinical samples and five environmental samples were sent to the National Center for Microbiology for species, family, and subtype identification using PCR followed by sequencing.

Results: Viral and bacterial testing yielded negative results. Fifty-three samples tested positive for Cryptosporidium spp. by immunochromatography and microscopy, whereas 85 were negative. Real-time PCR confirmed the positive results and enabled the identification of false-negative results obtained by immunochromatography. Clinical and environmental samples analyzed at the National Center for Microbiology tested positive for C. hominis, with subtype IfA12G1R5 being the most frequently detected.

KEY WORDS

Cryptosporidium hominis, cryptosporidiosis, disease outbreaks, waterborne diseases, polymerase chain reaction, molecular epidemiology.

INTRODUCCIÓN

El género Cryptosporidium spp. pertenece al filo Apicomplexa, subclase Coccidia. Entre las más de 26 especies incluidas en el género Cryptosporidium, C. hominis y C. parvum son las más frecuentemente detectadas en humanos. Cryptosporidium spp. es un protozoo de distribución cosmopolita que se transmite por vía fecal-oral, a través de agua contaminada que contiene ooquistes, la forma infectiva del parásito, resistente a la cloración.

Cryptosporidium parvum infecta tanto a humanos como a animales (ganado), mientras que C. hominis infecta exclusivamente a los seres humanos. La infección presenta un patrón estacional, con un pico de incidencia durante el verano. Su periodo de incubación oscila entre 4 y 22 días y posee una dosis infectiva baja (10-30 ooquistes). La infección suele producir una diarrea autolimitada que afecta principalmente a la población infantil. La capacidad de Cryptosporidium spp. para causar brotes de enfermedad gastrointestinal¹, tanto por transmisión directa entre personas como a través del agua, constituye un importante problema de salud pública. De hecho, Cryptosporidium es responsable del 77 % de los brotes de protozoos parasitarios transmitidos por el agua notificados a nivel mundial.

Los métodos diagnósticos incluyen ensayos inmunocromatográficos para la detección de antígenos, microscopía para la identificación de ooquistes en muestras frescas o mediante tinción de Kinyoun (de mayor rendimiento), y técnicas de amplificación de ácidos nucleicos para la identificación de especies. Estas herramientas permiten una adecuada caracterización de los brotes.

OBJETIVO

El objetivo de este estudio es describir y caracterizar un brote de Cryptosporidium hominis mediante diagnóstico microbiológico utilizando técnicas moleculares.

METODOLOGÍA

Entre septiembre y octubre de 2023, el Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza (España) recibió 138 muestras de heces procedentes de pacientes con síntomas de gastroenteritis infecciosa (principalmente diarrea y, de forma excepcional, vómitos y fiebre), pertenecientes al Área de Salud de Tarazona, que atiende a una población aproximada de 11.000 habitantes. Tarazona es una localidad situada en el extremo occidental de la provincia de Zaragoza (41°54′16″N, 1°43′27″O), a 86 kilómetros de la capital, a 10 kilómetros de la provincia de Soria (Castilla y León) y a tan solo 7 kilómetros de la Comunidad Foral de Navarra. Se encuentra en el valle medio del río Queiles, de 45 kilómetros de longitud, que atraviesa las tres comunidades autónomas mencionadas y constituye una fuente de abastecimiento de agua para consumo humano.

El centro de salud de Tarazona notificó formalmente al Servicio de Microbiología y Parasitología la sospecha de un brote epidemiológico. Como consecuencia, se llevó a cabo un análisis exhaustivo de todas las muestras recibidas. Se realizaron estudios virológicos, bacteriológicos y parasitológicos en todas las muestras. El estudio virológico se efectuó mediante técnicas de inmunocromatografía (CerTest Biotec®) para la detección de adenovirus, rotavirus, astrovirus y norovirus. El estudio bacteriológico consistió en coprocultivos realizados en medios de cultivo convencionales, incluyendo agar CCDA, agar MacConkey, agar Hektoen, agar CIN y agar XLD (bioMérieux®).

Para el estudio parasitológico se empleó inmunocromatografía (OPERON®) para la detección de antígenos de Cryptosporidium spp., Giardia lamblia y Entamoeba histolytica, complementada con el examen microscópico de muestras concentradas mediante tinción de Kinyoun y técnicas moleculares de PCR (CerTest Biotec®). El ADN de las muestras fecales se extrajo utilizando el sistema magLEAD 12Gc (PSS®), y la identificación del género se realizó mediante el kit VIASURE Cryptosporidium, Giardia & E. histolytica Real-Time PCR Detection Kit (CerTest Biotec®).

Ante la sospecha de una fuente común de infección, la investigación se centró inicialmente en el agua del río que abastecía a distintas localidades mediante pozos y fuentes públicas. Con este fin, se recogieron nueve muestras ambientales correspondientes a distintos puntos del sistema de abastecimiento del río. Paralelamente, como medida preventiva y de control, las autoridades sanitarias suspendieron temporalmente el suministro de agua para consumo humano hasta esclarecer el origen del brote. Como alternativa, el Ayuntamiento de Tarazona distribuyó garrafas de agua entre la población. Asimismo, se recomendó a las personas con síntomas de gastroenteritis abstenerse de utilizar aguas recreativas, como piscinas, para evitar nuevos contagios.

Con el objetivo de lograr la máxima precisión en la identificación del microorganismo responsable, el Laboratorio de Microbiología remitió 34 muestras clínicas y cinco muestras de agua al Centro Nacional de Microbiología para la identificación de la especie, familia y subtipo del agente etiológico.

Para el procesamiento de las muestras de agua se filtraron volúmenes de 100 litros mediante membranas de 45 µm (Millipore®). El ADN de las muestras de agua y heces se extrajo utilizando el kit IBIAN® DNA Stool Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se amplificó un fragmento de la subunidad 18S del ARN ribosómico (18S rRNA o SSU rRNA) mediante PCR anidada, siguiendo el protocolo descrito por Xiao et al. (1999)². La identificación de las especies de Cryptosporidium se realizó mediante análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP), utilizando los productos de la PCR secundaria, que fueron digeridos con las enzimas SspI y VspI a 37 °C durante toda la noche.

Para la identificación de las familias y subtipos se amplificó un fragmento del gen gp60 mediante PCR anidada, siguiendo el protocolo descrito por Alves et al. (2003)³. Posteriormente, los productos de PCR se purificaron mediante el kit GFX™ PCR DNA Gel Band Purification Kit (Biotools) y se secuenciaron directamente. Las secuencias nucleotídicas obtenidas se analizaron y compararon con las depositadas en la base de datos GenBank, utilizando los programas Chromas y BioEdit.

RESULTADOS

El análisis de virus y bacterias fue negativo en todas las muestras. De las 138 muestras clínicas analizadas, 53 resultaron positivas para Cryptosporidium spp. mediante inmunocromatografía, mientras que 85 fueron negativas. Entre las 53 muestras positivas, se observaron ooquistes en 49 mediante microscopía, hallazgo que se confirmó por PCR en tiempo real. En las cuatro muestras restantes no fue posible realizar la PCR por material suficiente.

De las 85 muestras negativas por inmunocromatografía, 47 también fueron negativas tanto por microscopía como por PCR. Sin embargo, 27 de las muestras inicialmente negativas mediante inmunocromatografía resultaron positivas por PCR. En las 11 muestras restantes no pudo realizarse la PCR debido a la escasa cantidad de muestra disponible.

Los análisis realizados en el Centro Nacional de Microbiología concluyeron que Cryptosporidium hominis subtipo IfA12G1R5 (n = 7) fue el genotipo predominante, seguido de IaA13R7 (n = 4), IbA12G3 (n = 2) e IbA10G2 (n = 1). En dos muestras únicamente fue posible determinar el género, la especie y la familia (C. hominis, familia Ia y C. hominis, familia If), mientras que en otras cuatro sólo pudo identificarse la especie. El resto de las muestras resultaron negativas. Estos resultados probablemente se debieron a la escasa cantidad de muestra clínica disponible, a una concentración insuficiente de ADN parasitario o a la degradación de las muestras.

En cuanto a las muestras ambientales, Cryptosporidium hominis se identificó en una de ellas, mientras que las restantes resultaron negativas.

Tras confirmarse la presencia del microorganismo en el agua del río, el Gobierno de Aragón, a través de la Dirección General de Interior y Emergencias, instaló diez depósitos de agua con una capacidad total de 10.000 litros en las localidades afectadas como medida provisional hasta la eliminación del parásito.

Finalmente, dos meses después del inicio del brote, la población pudo reanudar el consumo de agua procedente del río.

CONCLUSIONES

Nos enfrentamos al mayor brote de gastroenteritis por Cryptosporidium detectado en España y a uno de los mayores registrados en Europa. De hecho, las autoridades sanitarias europeas alertaron del incremento de casos de infecciones intestinales causadas por este microorganismo desde finales del verano de 2023. En España, entre enero de 2023 y el 31 de octubre de ese mismo año, las comunidades autónomas notificaron un total de 3.462 casos de criptosporidiosis a la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica. Entre los países más afectados se encontraban España, Luxemburgo, Países Bajos y Reino Unido.

El análisis microbiológico de las muestras clínicas y ambientales fue fundamental para identificar el microorganismo responsable del brote, permitiendo la adopción de medidas de prevención y control dirigidas a interrumpir su transmisión.

A pesar de su elevada sensibilidad y de la rapidez en la obtención de resultados, las pruebas rápidas de detección de antígenos pueden producir falsos negativos en pacientes con baja carga parasitaria (PCR con Ct > 30). El diagnóstico de la criptosporidiosis se basa habitualmente en la visualización microscópica de ooquistes en muestras fecales concentradas teñidas mediante la técnica de Kinyoun. Sin embargo, la gran diversidad de especies y subtipos de Cryptosporidium dificulta su identificación mediante métodos convencionales, lo que pone de manifiesto la importancia de emplear técnicas diagnósticas avanzadas. En este sentido, la PCR presenta una sensibilidad superior a los métodos tradicionales, especialmente en muestras con baja carga parasitaria, y permite identificar de forma rápida el género, la especie y los subtipos de Cryptosporidium spp. Esta capacidad de caracterización molecular resulta esencial para comprender la diversidad genética del parásito durante los brotes epidemiológicos, en los que la identificación de la fuente de infección es clave para establecer medidas eficaces de control.

El subtipo detectado con mayor frecuencia fue IfA12G1R5. La elevada prevalencia de este subtipo sugiere que está desplazando progresivamente a IbA10G2^4,5,6, considerado hasta ahora el subtipo predominante en nuestra área geográfica, en consonancia con las tendencias descritas en otros países europeos, así como en Estados Unidos y Australia.

La identificación de Cryptosporidium hominis como agente causal del brote apuntó a un origen humano de la contaminación, siendo el agua la principal vía de transmisión.

La investigación se amplió a las localidades situadas aguas arriba del río, en la provincia de Soria, con el objetivo de localizar el punto de origen de la contaminación. Se recogieron muestras en tres puntos del río: cerca de su nacimiento, aguas abajo de la localidad de Vozmediano (donde existe una piscifactoría) y en el límite con la provincia de Zaragoza. Todas las muestras resultaron positivas para Cryptosporidium hominis, por lo que no fue posible identificar con precisión cuál de los tres tramos del río constituía el punto inicial de la contaminación.

En conclusión, la vigilancia microbiológica activa, la notificación precoz y la colaboración multidisciplinar son elementos fundamentales para la detección temprana, la contención y la adecuada caracterización de posibles brotes epidemiológicos.

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