Examen microscópico, tipos de tinciones bacterianas.

AUTORES

1. José María Monteagudo Fontana. Celador. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
2. Andrea Espartero González. Técnico de laboratorio diagnóstico clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
3. Sergio López Ferreruela. Celador. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
4. Yasmina Urcía Juberías. Técnico de laboratorio diagnóstico clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
5. Ada Bayod García. Enfermera. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Lozano Blesa. Zaragoza.
6. Beatriz Jiménez Moraleda. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.

RESUMEN

Las tinciones bacterianas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las bacterias.

Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las bacterias sean visualizadas microscópicamente con mayor facilidad.

PALABRAS CLAVE

Colorantes, preparación de un frotis, tinción de Gram, tinción de Ziehl-Neelsen y espiroquetas.

ABSTRACT

Bacterial stains are a set of processes that lead to the staining of the structures that make up bacteria.

This is intended to increase the contrast between these structures and the environment that surrounds them, and allows bacteria to be viewed microscopically more easily.

KEY WORDS

Colorants, preparation of a smear, Gram stain, Ziehl-Neelsen stain and spirochetes.

INTRODUCCIÓN

La morfología bacteriana puede ser estudiada de dos formas distintas:

• Por visualización de los microorganismos vivos sin teñir, lo que nos permite además observar su posible movilidad.
• Por visualización de los microorganismos teñidos mediante colorantes, con una concentración tal que hacen morir a la bacteria y no permiten observar su movilidad, pero sin embargo se mejora la visualización de su morfología y otras estructuras según el tipo de tinción llevada a cabo.

En general todas las bacterias vivas son prácticamente incoloras, no presentando suficiente contraste con el medio acuoso donde se encuentran suspendidas, con lo cual no pueden ser observadas con claridad. Pero si se tiñen se produce un gran contraste con respecto al medio que las rodea. Además, alguno de estos colorantes puede teñir estructuras internas de la bacteria, lo que nos sirve para su identificación.

Por todo esto, las principales ventajas de las técnicas de tinción son:

• Observar más adecuadamente su morfología.
• Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitirá diferenciar distintos tipos morfológicos.
• Establecer una información complementaria sobre sus estructuras internas y/o externas que no podrían ser observadas por examen en fresco.
• Conocer sus características tintoriales orientándose hacia un grupo taxonómico u otro en la clasificación bacteriana.

OBJETIVO

El objetivo principal de esta revisión bibliográfica es poder tener una referencia general de las tinciones bacterianas y conocer las más usadas para la observación microscópica y clasificación de las mismas, en los laboratorios de microbiología.

METODOLOGÍA

Esta revisión bibliográfica se ha llevado a cabo recabando aquella información que se ha considerado relevante en distintas bases de datos como son Scielo, Elsevier y Medigraphic. Como buscadores de bibliografía se ha utilizado Google Académico y Pubmed lo que ha ofrecido la posibilidad de consultar contenidos de MEDLINE, así como una amplia gama de revistas científicas relacionadas con investigaciones biomédicas.

RESULTADOS

En general, las técnicas de tinción son imprescindibles para el estudio microbiológico de las bacterias siendo el primer paso para la identificación y son apoyadas por otras técnicas como, por ejemplo, las pruebas bioquímicas ¹.

Existen muchos factores que pueden alterar los resultados en toda técnica de tinción. A continuación, les nombraremos los más importantes ¹:

• Pureza del colorante: A mayor grado de impurezas, mayor error, y menor calidad en la tinción ¹.
• Concentración del colorante: Las cantidades ideales se mueven entre 0,2 y 2% ¹.
• El pH del colorante: Este factor hace que el pH se fije o no a las estructuras del microorganismo, permitiendo distinguir unos gérmenes de otros, si es demasiado rosa puede ser por un pH bajo y si es demasiado azul por un pH alto ^1,2.
• Conservación del colorante: Se mantendrá siempre en lugares frescos, secos y oscuros, con su envase correspondiente y su etiqueta ¹.
• Técnica empleada: A la hora de realizar una tinción se tendrá máximo cuidado en que los portaobjetos y sus cubres están siempre limpios y desengrasados ya que pueden aparecer artefactos o/y precipitados en la extensión, no se mezclaran los colorantes, etc.^1,2
• Cantidad de la muestra: Deberá ser representativa y homogénea pero no muy extensa ¹.
• Realizar correctamente el frotis: Si se pretende visualizar una muestra se fijará previamente, generalmente con calor. Si no se hace este paso los gérmenes no quedan adheridos al portaobjetos y a la hora de añadir colorantes mordientes los microorganismos son arrastrados y no se podrán ver¹.
• Tiempos de tinción: Es importante que todos los colorantes usados se mantengan en la preparación un tiempo preciso, variable según la tinción, generalmente entre uno y diez minutos ^1,2.

Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teñidores automáticos ².

Para teñir los microorganismos se necesita de un gran número de compuestos orgánicos e inorgánicos con carácter coloreado: Los colorantes, que según su estructura molecular se clasifican en ^1,2:

• Colorantes según su origen:

1. Colorantes naturales: Son extraídos de animales y sobre todo de plantas. Por ejemplo, la hematoxilina extraída del tronco de una planta que por oxidación origina la hemateína, el azul de índigo que corresponde al extracto de una leguminosa o el carmín extraído de un animal, la cochinilla ¹.
2. Colorantes artificiales: Preparados artificiales obtenidos en su mayor parte de alquitrán de hulla. Los ejemplos más conocidos son el cristal violeta, violeta de genciana, fucsina básica, ácido pícrico, azul de metileno, etc. ¹.

• Colorantes según su comportamiento químico:

En general un colorante, dependiendo de su estructura físico-química, se unirá de una forma más estable a la estructura que tiñe. De acuerdo con esto, aparecen:

1. Colorantes ácidos o aniónicos: Tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, son colorantes citoplasmáticos ya que estos captan muy bien los colorantes ácidos. El principal de ellos es la eosina ^1,2.
2. Colorantes básicos o catiónicos: Tienen una especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como son los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno ^1,2.
3. Colorantes neutros: Son sales de de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno ^1,2.
4. Colorantes indiferentes: Son insolubles en agua, tiñendo a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante. Son los colorantes de los lípidos, por ejemplo, Sudán III, Negro Sudán, etc. ^1,2.

La preparación de extendidos para la tinción es necesaria para lograr una observación óptima de las partes de la bacteria. El término tinción significa simplemente colorear los microorganismos con un colorante que destaque ciertas estructuras ³.

Toda técnica de tinción requerirá de los siguientes pasos: Realización de un frotis y fijación posterior, coloración, decoloración, lavado, coloración de contraste y finalmente observación al microscopio ^1,3.

Las tinciones bacterianas se dividen en los siguientes tipos:

• Tinción simple: Consiste en la aplicación de un solo colorante a la muestra, esta debe ser posterior a la fijación de la misma, permitiendo la visualización de la morfología bacteriana. Uno de los colorantes más indicados es el azul de metileno, que actúa rápida y suavemente sobre todas las células bacterianas y no oscurece los detalles celulares. Además, es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe ⁴.
• Tinción negativa: Es un tipo de tinción simple pero con ciertas diferencias, ya que nos permite observar características estructurales de la bacteria además de su morfología, se caracteriza por no necesitar fijación previa y nos permite visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria además de alguna otra característica estructural, como es la presencia de cápsulas ¹.
• Tinciones diferenciales: Se necesitará fijación previa generalmente por calor, además se utilizarán dos colorantes, siendo el último el colorante de contraste. Una de las características más importantes es que además de visualizar la morfología nos permite observar la composición de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloración ácida, etc.; como sucede en la tinción de Gram y en la tinción de Ziehl-Neelsen ¹.

Tinción de Gram: Christian Gram estaba buscando una tinción para visualizar bacterias en biopsias de tejidos y terminó por descubrir todo un nuevo mundo, el método capital para diferenciar grandes grupos microbianos por microscopía en función de la distinta composición de su pared bacteriana ^1,5.

Es el método más empleado en bacteriología gracias al cual las bacterias se pueden clasificar en 2 grandes grupos (Gram +, Gram -). Esto es debido a la distinta composición de la pared de las células bacterianas. Se basa en el empleo de un primer colorante básico (cristal violeta o violeta de Genciana) que teñirá de color azul todas las bacterias. Posteriormente, un mordiente (lugol) aumentará la afinidad del primer colorante a las células, oséa que lo fijará; finalmente, un agente decolorante decolorará solamente un tipo de bacterias que serán teñidas con el colorante de contraste o segundo colorante. Esto se debe a la composición de la pared bacteriana, hecho que servirá para clasificarlas como Gram+ (aquellas que no han sido decoloradas y que por lo tanto quedan teñidas con el cristal violeta de color azul violáceo) o como Gram- (aquellas bacterias que han sido decoloradas y son teñidas con el colorante de contraste, la safranina; con un color rosa-rojo) ¹.

Tinción de Ziehl-Neelsen : Se ha demostrado que algunas bacterias contienen un alto porcentaje de sustancias lipídicas o serosas, por lo que se tiñen con dificultad por los procedimientos usuales como la tinción de Gram. Se usa especialmente para la identificación de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, respectivamente ⁷.

La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que permita el paso libre del colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los ácidos micólicos presentes en la pared, Al enfriar con agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar, resistiendo la acción abrasiva del alcohol-ácido, y el azul de metileno se utiliza como colorante de contraste ⁶.

• Tinciones especiales: Este tipo de tinciones requieren de colorantes fluorescentes, como por ejemplo, la tinción de auramina-rodamina o la tinción de naranja de acridina que utilizan colorantes fluorescentes de forma especial utilizándose generalmente para visualizar productos patológicos con escaso número de microorganismos ¹.

Se basa en el uso de fluorocromos que se unen a ciertos microorganismos o estructuras de éstos, como es el caso de la tinción de naranja de acridina que se utiliza para la tinción selectiva y diferencial de ácidos nucleicos ¹.

CONCLUSIÓN

Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas. Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en el cuál se está sospechando y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas elementales, vigentes y de uso universal que ayudan al diagnóstico microbiológico.

BIBLIOGRAFÍA

• 1. Granados Pérez R, Villaverde Peris MªC. Examen Microscópico: Tinciones. En: López Raso MJ, et al, editores. Microbiología Tomo I. 2nd ed. Madrid: Paraninfo; 2014. p. 223-248.
  2. Rubio Campal F, García Espinosa B, Carrasco Carrasco M. Tinciones hematológicas. En: López Raso MJ, et al, editores. Fundamentos y Técnicas de Análisis Hematológicos y Citológicos. Madrid: Paraninfo; 2014. p. 45-54.
  3. Gerard J.Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. Observación de los microorganismos a través del microscopio. En: Gestora de derechos autorales, S.L., et al, editores. Introducción a la microbiología. 9a ed. Madrid: Ed. Médica Panamericana; 2007. p. 55-74.
  4. Luna Fontalvo J. Práctica 1 – Examen microscópico bacteriano (morfología y tinciones). En: Editorial Unimagdalena, et al, editores. Manual de Prácticas de Laboratorio: Microbiología General y Aplicada. Ciudad: Santa Marta – Colombia: Ed. De La Universidad De La Magdalena; 2012. p. 11-22.
  5. Walter Ledermann. La tinción de Gram decide la batalla. En: RIL editores, et al, editores. Una historia personal de las bacterias. Santiago de Chile. RIL editores; 2007. p. 56.
  6. Esaú López-Lacome L, Hernandez Duran M, Colín Castro A, Ortega Peña S, Ceron Gonzalez G, Franco Cendejas R, Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en Discapacidad [internet]2014[citado 20 julio 2021];3(1); pp 10-18.
  7. Tulio Rodriguez J. Prado Cohrs D. sección VII tinciones en microbiología. Organización Panamericana de la Salud, et al, editores. Microbiología: lo esencial y lo práctico. Guatemala; 2005. p. 222-226.