Enfermedad de Von Willebrand

 

AUTORES

1. Valvanera Uterga Rodríguez. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Clínica Veterinaria Albeitar, Zaragoza. España.
2. Aroa Calvo Sanjuan. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Facultad de Veterinaria de Zaragoza, Zaragoza. España.
3. Marta Fernández Marín. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Nuestra Señora de Gracia, Zaragoza. España.
4. Marta Iglesias Belles. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Nuestra Señora de Gracia, Zaragoza. España.
5. Olaia Grijalbo Barcenilla. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Facultad de Veterinaria de Zaragoza, Zaragoza. España.
6. Joan Marín Egea. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Facultad de Veterinaria de Zaragoza, Zaragoza. España.

 

RESUMEN

El factor de von Willebrand (FvW) es una glicoproteína plasmática de gran tamaño que tiene un papel esencial en el proceso de la hemostasia, actuando tanto en la adhesión plaquetaria al subendotelio vascular como en la estabilización y protección del factor VIII frente a su degradación. Su correcto funcionamiento es crucial para la formación del tapón plaquetario primario y para la adecuada generación del coágulo en la cascada de coagulación.

En este trabajo se analizan las principales técnicas utilizadas en el laboratorio clínico para la evaluación cualitativa y cuantitativa del FvW. Entre las pruebas fundamentales se encuentran la determinación antigénica del factor (vWF:Ag), que mide su concentración plasmática, y la actividad cofactor de ristocetina (vWF:RCo), que evalúa la capacidad funcional del FvW para mediar la agregación plaquetaria en presencia de ristocetina. Junto con esto, se incorpora la medición de la actividad del factor VIII (FVIII:C), ya que su deficiencia secundaria puede reflejar alteraciones en el FvW, particularmente en la enfermedad de von Willebrand (EvW).

Además, se incluyen pruebas complementarias como la electroforesis en gel de agarosa, que permite visualizar el patrón multimérico del FvW. Esta técnica resulta de gran utilidad para distinguir entre los distintos subtipos de la EvW, especialmente los de tipo 2, que se caracterizan por una alteración estructural o funcional del FvW con pérdida selectiva de los multímeros de alto peso molecular.

Se aborda también la influencia de factores preanalíticos y biológicos, como el estrés, el ejercicio, el grupo sanguíneo y el uso de ciertos fármacos, así como aspectos metodológicos que pueden afectar la interpretación de los resultados. Estas variables pueden inducir variaciones fisiológicas o artefactuales en los niveles y la actividad del FvW, por lo que es imprescindible tenerlas en cuenta para evitar diagnósticos erróneos.

En conjunto, se resalta la necesidad de una estrategia diagnóstica integral, que combine múltiples parámetros y técnicas complementarias. Una correcta interpretación de los resultados de laboratorio, en el contexto clínico adecuado, es fundamental para lograr una clasificación precisa de los distintos tipos de EvW y garantizar así un tratamiento individualizado y eficaz para cada paciente.

PALABRAS CLAVE

Enfermedad de von Willebrand, factor de von Willebrand, trastornos hemorrágicos hereditarios, hemostasia, diagnóstico de laboratorio, coagulación.

ABSTRACT

This final degree project presents a bibliographic review focused on the diagnostic methods used for the detection of von Willebrand disease (vWD), a common hereditary bleeding disorder caused by a deficiency or dysfunction of von Willebrand factor (vWF). The objective is to describe and compare the main laboratory tests currently applied to assess vWF levels and activity, and to explain their relevance in the diagnosis and classification of vWD.

The review covers the most relevant diagnostic procedures, including von Willebrand factor antigen (vWF:Ag), ristocetin cofactor activity (vWF:RCo), factor VIII activity (FVIII:C), and multimer analysis. The strengths and limitations of each technique are discussed, along with the influence of variables such as blood type, stress, and age on test results. Particular attention is given to the complexity of result interpretation and the necessity of combining multiple assays to achieve an accurate diagnosis⁹.

KEY WORDS

Von Willebrand disease, von Willebrand factor, hereditary bleeding disorders, hemostasis, laboratory diagnosis, coagulation.

DESARROLLO DEL TEMA

El factor de von Willebrand (FvW) es una glicoproteína multimérica básico en la coagulación sanguínea, cuya principal función es mediar en la adhesión plaquetaria al endotelio vascular cuando está dañado y estabilizar el factor VIII en la circulación. Esto se conoce gracias al médico finlandes Erik von Willebrand, quien en 1926 describió un trastorno hemorrágico hereditario en una familia de las Islas Åland. Y se dejó atrás la denominación de pseudo hemofilia, ya que se pensaba que se debía a una lesión en las paredes de los vasos. Desde entonces, múltiples estudios han permitido entender en profundidad la función del FvW, así como su repercusión en diversos trastornos hematológicos y cardiovasculares. La enfermedad de von Willebrand consiste en la variación de este factor pudiendo tener una alteración en la función o en la concentración.

La función principal del FvW en la coagulación sanguínea es su capacidad de facilitar la adhesión de las plaquetas a la pared vascular en sitios de lesión. En situaciones de normalidad, el FvW se almacena en los cuerpos de Weibel-Palade de las células endoteliales y en los gránulos α de las plaquetas, desde donde se libera en caso de daño vascular. Su función es especialmente importante en los vasos de alto flujo, como las arterias, donde permite que las plaquetas se unen al colágeno expuesto y forman el tapón hemostático primario o tampo blanco. Además, el FvW actúa como transportador y protector del factor VIII, evitando su degradación prematura y asegurando el buen funcionamiento de la cascada de coagulación.

La importancia clínica del FvW se hace evidente en la enfermedad de von Willebrand (EvW), ya que es el trastorno hemorrágico hereditario más frecuente. Se estima que aproximadamente el 1 % de la población mundial presenta algún grado de deficiencia o disfunción de esta proteína, solo una pequeña minoría desarrolla síntomas clínicamente significativos. Aunque se considera que las formas clínicamente significativas de la enfermedad afectan a 100 personas por cada millón de la población. Al ser un trastorno hereditario que no está ligado a los gametos este afecta tanto a hombres como mujeres de manera igualitaria, pero si es bien sabido que los síntomas en mujeres son más evidentes y de mayor gravedad. Es relevante mencionar que si hay factores que pueden alterar los niveles de factor de von Willebrand, como son el grupo sanguíneo, el embarazo, la inflamación o ciertos medicamentos.

La EvW se manifiesta en diferentes grados de importancia según la gravedad de los síntomas, desde hemorragias leves, como epistaxis recurrente o menorragia, hasta episodios hemorrágicos graves que pueden comprometer la vida del paciente, como sangrados intestinales. La enfermedad se clasifica en tres tipos principales: el tipo 1, caracterizado por una deficiencia parcial del FvW; el tipo 2, que implica una alteración en la función de la proteína; y el tipo 3, la forma más severa, en la que el FvW está prácticamente desaparecido.

El diagnóstico de la EvW es complejo y requiere una combinación de pruebas de laboratorio para medir la concentración y funcionalidad del FvW, junto con los niveles de FVIII. Además de esta patología, se ha demostrado que el FvW también desempeña un papel clave en otras enfermedades hematológicas y cardiovasculares. Niveles elevados de esta proteína en la sangre han sido asociados con un mayor riesgo de trombosis, infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares, lo que resalta su relevancia no solo en la hemostasia, sino también en la fisiopatología de enfermedades trombóticas e inflamatorias.

Dado el papel central del FvW en la coagulación sanguínea y su implicación en múltiples trastornos clínicos, su estudio resulta de gran interés tanto en la investigación biomédica como en la práctica médica. El presente trabajo tiene como objetivo analizar en profundidad la estructura, función e importancia clínica del FvW, con especial énfasis en su relación con la enfermedad de von Willebrand y otras condiciones patológicas. Para ello, se llevará a cabo una revisión detallada de la literatura científica más reciente, explorando los avances en el diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades, así como las perspectivas futuras en la investigación de este factor esencial en la hemostasia¹.

¿Qué es el factor de Von Willebrand?

Enfermedad de von Willebrand: Tipos y clasificación

La enfermedad de von Willebrand es la alteración de coagulación más frecuente, esta alteración puede ser cuantitativa o cualitativa. El factor de von willebrand es una glicoproteína multimérica esencial en hemostasia primaria, que se activa cuando hay daño en el endotelio agregando plaquetas sobre la superficie dañada. También actúa como transportador del factor VIII, estabilizando y alargando su vida en el torrente sanguíneo.

La molécula del factor de von Willebrand se produce en el endotelio y en los megacariocitos y se almacena en los gránulos alfa de las plaquetas y en el tejido conectivo subendotelial

El gen que se encarga de las síntesis de FvW se encuentra localizado en el cromosoma 12, brazo corto. La transmisión de este gen puede darse de manera autosómica dominante o recesiva, aunque hay maneras de que la enfermedad de von Willebrand sea adquirida. Para la función correcta de FvW se precisa de la regulación del tamaño del multímero ADAMTS 13, que es el encargado de la fragmentación de los multímeros de gran peso molecular que son los de afinidad con las plaquetas².

La enfermedad de Von Willebrand se clasifica en 3 tipos principales, siendo que el tipo dos tiene diferentes subtipos.

Empezando con el tipo 1, es el tipo más común en esta patología, siendo que aproximadamente un 85% de las personas que padecen esta enfermedad sufren de este tipo. La característica más importante de este tipo es que tienen un factor de Von Willebrand inferior a lo que es considerado normal, este funciona de manera adecuada pero la poca cantidad de este factor genera que el cuerpo humano no pueda realizar la coagulación de manera adecuada, esto genera que las personas que tengan esta tipo de alteración puedan tener sangrados leves o moderados que esté asociado a traumatismos o intervenciones quirúrgicas. Aunque también pueden darse complicaciones asociadas a sangrados intensos, ya que en ocasiones el factor de von willebrand depende del factor VIII potenciando los síntomas.

Siguiendo con el tipo 2, es el segundo tipo más común siendo que el 15% de personas que sufren de esta patología tienen este subtipo. En este caso la cantidad de factor de von willebrand es la adecuada pero esta no funciona como debería. El factor de von willebrand tiene diferentes formas de actuar y estas fallan en diferentes partes, en ocasiones este factor puede interaccionar con las plaquetas poco o demasiado o con el factor VIII. El tipo 2 tiene 4 subtipos diferentes, estos se relacionan con los multímeros de la proteína.

• En el tipo 2A el factor más importante es que el tamaño no es adecuado lo que conlleva que las plaquetas no formen de manera adecuada tapones plaquetarios.
• En el subtipo 2B también está relacionado con el tamaño inadecuado de los multímeros, pero en este caso el factor de von willebrand se vuelve muy activo, generando que este se adhiera a las plaquetas cuando no es necesario, el cuerpo lo reconoce y elimina las plaquetas que están junto al fvw lo que genera una escasez tanto en las plaquetas como en el torrente sanguíneo.
• Subtipo 2M en este caso el problema principal no es el tamaño, es que el factor de von willebrand no se adhiere a las plaquetas no pudiendo generar tapones plaquetarios de manera adecuada.
• en el subtipo 2N el problema está relacionado con el factor de coagulación VIII, en este caso el factor de von willebrand no puede proteger ni portar el factor VIII, lo que genera un nivel bajo de factor VIII haciendo que el cuerpo no disponga de factor VIII para generar el coágulo de fibrina. Este subtipo también está relacionado con la hemofilia ya que comparten varios síntomas parecidos.

 

El último tipo de factor de von willebrand es el 3, que es considerado el menos común ya que la incidencia de este está en 1 en un millón de personas. Es el tipo con síntomas de mayor gravedad, ya que estos tienen muy poca cantidad de factor o nula, como en otros casos donde hay una falta de factor de von willebrand también está la deficiencia en el factor VIII. Lo que genera que estas personas tengan graves problemas a la hora de formar coágulos de fibrina, causando sangrados en las articulaciones y en los músculos sin ser conscientes de ello. Junto con estos síntomas también suelen experimentar epistaxis o sangrados en la boca de manera habitual. En el caso de las mujeres la complicación más importante suele estar ligada con la menstruación ya que suelen tener periodos más largos y abundantes³.

Junto con los tipos que se adquieren de manera hereditaria, ya sea autosómica dominante o de madera recesiva, también está el factor de von willebrand adquirido este muchas veces es mal diagnosticado o no se relaciona con el factor de von Willebrand. Es causado como consecuencia de síndromes linfoproliferativos y mieloproliferativos u otras situaciones patológicas del organismo, como son enfermedades cardiovasculares o cánceres malignos. Generalmente se encuentra en adultos sin antecedentes ni personales ni familiares. Esta disminución del factor de von willebrand se debe a que el cuerpo neutraliza el factor de von Willebrand, esto se denomina como depuración aumentada. Y la otra manera de la disminución se llama inhibición de la función, que sucede cuando los anticuerpos se unen de manera errónea al factor por lo que no puede realizar la función de coagulación de manera adecuada. También mencionar que ciertas enzimas pueden destruir de manera equívoca el factor dando una disminución en cantidad. Junto con esto ciertos tumores hacen que el factor de von Willebrand se adhiera a ello perdiendo la cantidad considerada normal en el torrente sanguíneo.

El factor de Von Willebrand adquirido está empezando a tener interés en la sociedad ya que tiene relación con trastornos cardiovasculares frecuentes, ya que algunos de los mecanismos están implicados en la fisiopatología del factor de von willebrand, como sería la degradación del factor⁴.

La enfermedad de pseudo von Willebrnad es una alteración hemorrágica autosómica dominante que causa una hiperactivación del receptor de las plaquetas. Esto pasa por una mutación missense en el codón 239 que reemplaza una metionina por una valina⁵.

Manifestaciones clínicas:

Las manifestaciones clínicas del factor de von Willebrand se centran principalmente en el estudio de un historial médico detallado, ya que los síntomas más característicos de esta patología son algunos que la sociedad se da con frecuencia y muchas veces no se les da la importancia que necesitan. El más importante sería la epistaxis o sangrado nasal que suelen tener de manera recurrente. Las laceraciones donde el sangrado se prolonga en el tiempo, ya sean de índole quirúrgico o de una herida. También suelen tener moretones sin causa aparente o aparición de petequias en la piel. En el caso de las mujeres suelen tener alteraciones en el ciclo menstrual, ya que estos son más abundantes y suelen tener periodos más prolongados. Así mismo las mujeres que dan a luz con esta patología suelen tener hemorragias más abundantes y prolongadas que la media. Y por último las intervenciones dentales ya que también padecen de sangrados copiosos y continuos.

Hay también ciertos síntomas que están más relacionados con subtipos de factor de von Willebrand, es el caso de hemorragias de tejidos blandos y hemorragias musculares que están ligados únicamente al tipo 3⁶.

También se ha asociado que los niveles elevados del factor de von Willebrand con ciertas inflamaciones como son arteritis y glomerulonefritis. La inflamación es una respuesta del organismo compleja, que empieza con la activación del sistema inmunológico. Las citoquinas se unen con los receptores y activan a las células endoteliales, estas activan en contenido de los cuerpo de Weibel palade, los cuerpos de weibel palade son gránulos de almacenamiento para FvW y p-selectina, al liberarse el factor de von Willebrand al torrente sanguíneo genera inflamación en los vasos sanguíneos⁷.

Las concentraciones del factor de von Willebrand pueden variar según el tipo sanguíneo del individuo , se ha visto que hay una relación entre los niveles del FvW y el grupo sanguíneo ABO. Hasta el 66% de las alteraciones en los niveles de factor de von Willebrand están relacionadas con mutaciones y el restante 30% con el grupo sanguíneo ABO.

Las personas con grupo sanguíneo O tienen una menor concentración de factor de von Willebrand, después están las personas con grupo A y B y finalmente las personas con grupo AB son las que más concentración del factor de von Willebrand tienen de forma natural. El tipo O tienen de media un 25 a 30% menos de concentración, esta deficiencia se puede detectar a partir del primer año de vida. Esto está asociado a la glicosilación, que es el proceso donde azúcares se unen proteínas, en este caso al factor de von Willebrand. La glicosilación es un proceso fundamental en la síntesis del factor de von Willebrand, ya que aproximadamente un 19% del peso de la proteína son azúcares añadidos en el proceso.

Parte importante de la glicosilación es la incorporación de determinantes del grupo sanguíneo, de los que posteriormente se incorporan a cadenas de oligosacáridos a través de los enlaces de asparagina en el FvW. Esta modificación ocurre en el aparato del Golgi de las células endoteliales.

Los pacientes con grupo sanguíneo O tienen menor glicosilación del FvW, lo que hace que esta sea menos estable. Junto con esto, la disminución de la glicosilación expone ciertos dominios de la proteína frente a enzimas que se encarga de fragmentar el FvW y reduciendo así la vida media de circulación, por ejemplo la metaloproteasa ADAMTS-13.

El perfil de glicosilación influenciado por el grupo sanguíneo no sólo cambia la estructura del factor de von Willebrand, sino que también determina la longevidad de este en el torrente sanguíneo. La diferencia de niveles de factor de von Willebrand en el grupo sanguíneo O puede tener consecuencias clínicas, ya que estos pacientes tienden al sangrado más prolongado que el resto de grupos sanguíneos⁸.

Toma de muestra y procesamiento:

En el proceso de toma de muestras y procesamiento hay varios factores a tener en cuenta, que van desde la preparación del paciente, hasta recolección, manejo, transporte y almacenamiento de las muestras. Esta fase es considerada una de las más delicadas del procesamiento de las muestras, ya que se considera que sobre el 70% de los errores en los resultados son generados en esta etapa. El primer paso antes de realizar cualquier prueba de laboratorio es importante analizar los factores que pueden afectar a los niveles de factor de von willebrand ya que ciertas enfermedades cardiovasculares, trastornos autoinmunes, cáncer, enfermedades linfoproliferativas o mieloproliferativas, e hipotiroidismo. Junto con esto otras situaciones que no sean patológicas también pueden modificar los niveles de FvW como el embarazo y el uso de anticonceptivas orales que contengan estrógeno, ya que estos están asociados a unos niveles más elevados del factor. También es de suma importancia evitar el estrés, sobretodo en niños pequeños ya que el llanto o la ansiedad pueden tener reacciones de elevación del factor de von Willebrand o el factor VIII, en relación con el estrés, tampoco hacer ejercicio físico en las dos horas previas a la extracción de sangre y es recomendable que el paciente esté en reposo 5 horas previamente. También existen otros factores externos que podrían comprometer el resultado de la prueba, estas siendo procesos inflamatorios o cirugías, porque incrementan los niveles plasmáticos del factor de von Willebrand. Siendo así necesaria la repetición de las pruebas en dos tomas de sangre en diferentes ocasiones.

A la hora del procesamiento de la muestra es indispensable que se haga según la normativa vigente, para asegurar unos resultados adecuados y sin riesgos sobre el personal sanitario que maneje la muestra.

En este caso se realiza mediante analíticas hematológicas que se recogen en tubos con anticoagulante de citrato sódico al 3,2%, en las pruebas de coagulación es importante que la cantidad de muestra sea la adecuada ya que en caso contrario podrían comprometer los resultados de esta. También mencionar que una vez la muestra está en el tubo es de suma importancia homogeneizar la sangre con el citrato sódico para garantizar la distribución homogénea del anticoagulante. El citrato sódico es un anticoagulante de unión reversible ya que estos se unen al calcio en la sangre parando así la cascada de coagulación.

A la hora del transporte es de vital importancia la temperatura de la muestra, ya que las muestras de sangre no se recomiendan transportar en frío, la temperatura óptima para estas es la temperatura ambiente, entre 15 °C y 25°C. En casos de la centrifugación de una sangre completa que ha sido conservada en temperaturas entre 2°C a 8°C puede causar reducciones falsas de factor de von willebrand y factor VIII.

Posterior a la extracción, la sangre debe procesarse de manera inmediata para obtener el plasma, ya que los ensayos para las muestras del factor de von willebrand se realiza en plasma pobre en plaquetas, esto se garantiza mediante una doble centrifugación de los tubos. Si los tubos se quieren mantener para un examen más tardío es necesario que estos se almacenen cerrados en una nevera de – 70°C, teniendo que ser analizados en los posteriores 18 meses. Para asegurar una descongelación sin incidencias es que se realiza una doble centrifugación, ya que en caso de que queden plaquetas en el suero el proceso de descongelación puede liberar proteasas o partículas de la membrana plaquetaria alterando los resultados. Así mismo una vez las muestras que estaban congeladas se descongelan para el uso deben ser usadas de manera inmediata y transportarse en el caso de ser necesario en hielo seco para evitar la formación de crioprecipitados. Y antes de realizar las pruebas descongelar en el tiempo de 5 minutos usando un baño caliente a 37°C y homogeneizar de manera suave⁹.

Diagnóstico y pruebas de laboratorio:

Para el correcto diagnóstico de esta patología es importante tener en cuenta no solo el resultado de las pruebas de laboratorio sino también tener en cuenta la historia familiar de los pacientes, siempre teniendo en cuenta de que aunque no se haya diagnosticado a otro familiar no excluye la posibilidad de padecer esta enfermedad. El proceso de diagnóstico empieza indagando en la historia familiar, buscando síntomas de hemorragias que no tengan un motivo aparente, así como petequias en la piel, epistaxis recurrente o facilidad a la hora de la aparición de moratones. Y en el caso de las mujeres se hará un historia de los ciclos menstruales e historiales de partos si se dispone de estos, ya que al tener alteraciones en la hemostasia suelen padecer de menorreas⁷.

En la atención primaria también se ha implementado un sistema de puntos según la gravedad de las hemorragias, el sistema BAT, por sus siglas en inglés Bleeding Assessment Tool. Este tipo de herramientas se usan antes de derivar a un paciente a las pruebas de laboratorio como un primer cribado. Para realizar el BAT se rellena un cuestionario en escala sobre los síntomas de las hemorragias, cada síntoma hemorrágico puntúa como 0 hasta el 4 según la gravedad de estos. Se tienen en cuenta 14 factores para hacer este test, en los resultados tenemos que tener en cuenta el sexo y la edad de los pacientes, ya que los valores normales en hombres son hasta 3 puntos, en mujeres de 5 y para los niños 2 puntos. Para que los resultados del test sean positivos en hombres tendrían que ser por encima de los 4 puntos, para mujeres por encima de 6 y los niños superior a 3 puntos¹⁰.

Las pruebas de laboratorio se encuentran divididas en 3 partes principales, las básicas o iniciales, que incluyen recuentos plaquetarios, tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada. Con el recuento de plaquetas se evaluará la hemostasia primaria y con el resto de pruebas se evaluará la hemostasia secundaria¹¹.

La función plaquetaria y las pruebas de TTPa y TP no son específicas para la detección del factor de von Willebrand, pero estas pueden dar resultados anormales cuando el caso de patología es muy grave¹².

Empezando con la pruebas que se usan para evaluar la hemostasia primaria, la más importante es el recuento plaquetario, en la mayor cantidad de tipos y de subtipos el recuento plaquetario es normal, donde no se aprecia una disminución significativa de plaquetas por lo que en los resultados se tendrán plaquetas en adultos está entre 150,000 y 450,000 plaquetas por microlitro (mcL) de sangre. Sin embargo en caso del tipo 2B al tener una activación de factor de von willebrand y este acoplarse a las plaquetas el organismo las elimina de manera precoz, dando lugar así a un recuento plaquetario inferior al normal.

La trombocitopenia se observa en aproximadamente el 30-67% de los pacientes, estos valores pueden depender de diferentes factores como infecciones, cirugías o embarazo. En algunos casos, los recuentos plaquetarios pueden ser persistentemente bajos (<150,000 mcL), mientras que en otros la trombocitopenia es intermitente y se agrava bajo estrés fisiológico o patológico. Estos recuentos pueden variar de moderadamente bajos siendo inferiores de 150,000 mcL o estar gravemente disminuidos llegando a estar sobre las 20,000 mcL.

Para realizar el recuento de plaquetas hay diferentes maneras, la manual o automática, empezando con la manual se realiza un frotis sanguíneo que se tiñe a posterior para diferenciar mejor los tipos de células sanguíneas

La manera automática para el conteo de las plaquetas se realiza mediante citometría de flujo. La Citometría de Flujo o CMF es una técnica de análisis celular multiparamétrico en el que el fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas alineadas y de una en una por delante de un haz láser focalizado.

Las células de interés se marcan con un fluorocromo mediante un anticuerpo. A posterior estas células se suspenden en un líquido y se impulsan a gran velocidad por un orificio estrecho, cuando pasan por una fuente luminosa, que generalmente es un láser. Este incide en cada célula y desvía la dirección de este, unos detectores recogen la desviación que genera cada célula, contando poblaciones celulares. Así mismo el reactivo fluorocromo al ser excitado por la luz del láser emite una luz en una determinada longitud de onda que los receptores captan¹³.

El tiempo de tromboplastina parcial activada o TTPa es una prueba que se realiza en los laboratorios de ámbito médico para la evaluación de la función de las vías intrínsecas como de la vía común de la coagulación. Permitiendo identificar alteraciones en la función del organismo. La coagulación es un proceso complejo multifactorial, en el que entran en juego diferentes factores de coagulación, células plasmáticas y el endotelio vascular.

La TTPa se usa principalmente para la detección de deficiencias en los factores de la coagulación, estos pueden ser la trombina que engloba factores tales como VIII, IX, XI, XII, X, V, II y el fibrinógeno que sería el factor I.

Para realizar la prueba, se obtiene una muestra de sangre del paciente en un tubo con citrato de sodio, que actúa como anticoagulante. Después se separa el plasma mediante centrifugación. Al plasma se le añade fosfolípidos, un activador de contacto (como caolín o sílice) y cloruro de calcio para iniciar la cascada de coagulación. Una vez la cascada de coagulación haya empezado se medirá el tiempo y este se registrará como el TTPa. Este se mide en segundos, los valores normales pueden cambiar según el laboratorio, pero lo más usual es entre 25 y 35 segundos.

Un tiempo prolongado puede indicar deficiencias en los factores de la vía intrínseca o común o el uso de anticoagulantes como la heparina. Los resultados de estas pruebas tienen que interpretarse dentro del contexto del paciente.

En el caso del tiempo de protrombina o TP es una prueba que se usa para evaluar la función de la vía extrínseca y de la vía común para formar coágulos de manera efectiva. Está considerada una prueba esencial para el diagnóstico y monitoreo de trastornos de trastornos hemorrágicos. La vía extrínseca de la coagulación se activa cuando hay daño tisular, es una proteína de las células subendoteliales que entra en contacto con la sangre y se une con el factor VII, generando así el complejo factor tisular- factor VII. Una vez este factor está unido activa los factores de IX y X , lo que da resultado en la formación de fibrina que estabiliza el coágulo. En el tiempo de protrombina se mide el tiempo que tarda en formarse un coágulo después de que a la muestra se le añaden reactivos ricos en factor tisular y fosfolípidos.

Los resultados de esta prueba se pueden expresar de dos maneras, la primera siendo en segundos y la segunda como un índice normalizado (INR), esta última permite comparar resultados de diferentes laboratorios y por tanto estandarizar. Un resultado elevado puede indicar menor capacidad de coagulación, dando así lugar a un mayor riesgo de hemorragias. En cambio, un resultado disminuido podría derivar en mayor formación de coágulos, lo que conlleva a mayor riesgo de eventos trombóticos.

Es importante tener en cuenta la vitamina K, ya que varios factores de coagulación dependen de que el organismo tenga las cantidades necesarias para realizar la función de coagulación.

Históricamente la prueba de screening más usada ha sido el tiempo de sangría, ya que es una prueba simple para la evaluación de la función de las plaquetas. Consiste en medir el tiempo que tarda en detenerse una hemorragia después de realizar una incisión en la piel, como normal general esta incisión se realiza en el antebrazo o en el lóbulo de la oreja. Un tiempo prolongado puede indicar trombocitopenia, defectos en la función plaquetaria o alteraciones en los vasos sanguíneos.

Hay varias maneras de realizar esta prueba como son el método Duke, Ivy y el método de template. Dentro de estos métodos el Duke es el que más en desuso está, ya que en este método hay una gran variabilidad según el técnico que lo realiza y está menos estandarizado, aunque es el método menos invasivo de los tres. Este se realiza perforando el lóbulo de la oreja o la yema del dedo con una lanceta y se mide el tiempo que tarda en detenerse el sangrado. En el caso del método Ivy hay un estándar un poco más preciso, en este caso se realiza una incisión en el antebrazo de 5 milímetros de largo y 1 mm de profundidad se aplica presión con un esfigmomanómetro inflado en 40 mmHg. Se va recogiendo la sangre con una gasa sin tocar la herida y se mide cuánto tiempo tarda en parar el sangrado. Los resultados más habituales de esta prueba oscilan entre 2 a 9 minutos. Esta prueba se ha dejado de hacer hoy en día ya que si bien hay una estandarización de los resultados estos pueden estar sujetos a factores externos como serían la temperatura, presión o técnica empleada por el operador¹⁴.

En el caso de las pruebas específicas permiten cuantificar factores individuales, estas se usan cuando parte de las pruebas básicas aparecen alteradas o cuando dan resultados dentro de los valores normales, pero el historial clínico da lugar a sospechas de problemas en las coagulopatías. Se realizan dos tipos de ensayos, funcionales e inmunológicas. Las primeras se hacen por métodos de coagulación que utilizan plasmas deficientes del factor a analizar. Esta es FVW:Ag que mide la cantidad total que hay, para realizar esta prueba se puede hacer de dos maneras diferentes, mediante un inmunoensayo ligado a enzimas (Elisa) o mediante un inmunoensayo de látex automatizado (LIA), normalmente no se realizará esta última ya que es menos específica y puede dar falsos positivos puesto que en ciertas ocasiones interactúa con el factor reumatoide. Tanto en esta pruebas como en las demás hay que tener en cuenta que el factor de von willebrand es una proteína que aparece en momentos donde el cuerpo está sufriendo inflamación y por lo tanto pueden aumentar los valores cuando el epitelio vascular esté dañado¹⁰.

El ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) es una técnica fundamental para la detección y cuantificación de sustancias antigénicas, como proteínas, anticuerpos y otros biomarcadores, en muestras biológicas. Su principio básico se basa en la interacción entre antígenos y anticuerpos, donde uno de estos componentes está inmovilizado una placa de microtitulación⁵.

Procedimiento general de un Elisa Sándwich para factor de von Willebrand.

El procedimiento empieza con el recubrimiento de los pocillos en una placa de microtitulación con un anticuerpo específico para el factor de von Willebrand. Este Ab puede ser policlonal o monoclonal, este se quedará en el fondo del pocillo y actuará como agente captador del antígeno. Este se bloquea con una solución proteica, la más utilizada en el caso del fvw es albúmina sérica bovina con el fin de reducir las uniones inespecíficas.

Posterior a esto se añade el segundo anticuerpo anti FvW, que está conjugado con una enzima que suele ser la fosfatasa alcalina. Esto reconoce un epítopo diferente del mismo Antígeno, generando así el tipo Elisa sandwich. Una vez las placas están en este punto se dejan incubar para que se una el complejo antígeno-anticuerpo, después de este periodo se realizan lavados con la intención de eliminar los anticuerpos que no se han conjugado específicamente.

Seguidamente a esto se incorpora el sustrato correspondiente a la enzima utilizada, lo que genera una reacción cromogénica visible al ojo humano. Estas microplacas se tendrán que almacenar en unas condiciones de temperatura específica y de luz controlada durante el tiempo adecuado. Posteriormente se podrá leer en un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 mn, antes de usar el lector de microplacas hay que detener la reacción para que uniones inespecíficas no ocurran, esto se realiza mediante una solución ácida. Los resultados que proporciona el lector de microplacas se pueden cuantificar mediante una curva conocida de proteína purificada del factor de von Willebrand. De esta manera se obtienen los valores precisos de cada muestra¹⁶.

La técnica de inmunoensayo de látex o LIA se basa en un principio de inmunoturbidimetria, los anticuerpos específicos se fijan sobre las microesferas de látex, provocando así una reacción de antígeno-anticuerpo con la muestra si esta contiene los antígenos. Esto conduce a un aumento de turbidez en la mezcla y por lo tanto aumenta la absorción del medio¹⁷.

El procedimiento general de LIA para detección de factor de von willebrand se empieza con la preparación de la muestra, esta será de plasma obtenido de la sangre del paciente con anticoagulante de citrato sódico. Se añaden unas gotas de la muestra sobre el portaobjetos preparado con las placas de látex, posteriormente se añade el reactivo y se homogeneiza. Una vez pasa el tiempo de espera de leeran los resultados, hay aglutinación el resultado es positivo ya que se ha formado una unión del antígeno- anticuerpo. En cambio si este no cambia de aspecto sería negativo¹⁸.

En cuestión de la actividad se mide con el cofactor de ristocetina (FvW: Rco), que es un antibiótico que se usa en laboratorio, ya que este tiene afinidad por las plaquetas haciendo que el factor de von Willebrand funcional se una a las plaquetas. Si el factor de von willebrand está funcionado adecuadamente se unirá a las plaquetas y estas se agruparán formando una agregación plaquetaria, si en cambio el factor no está funcionando de manera adecuada las plaquetas no se agruparán, aunque la ristocetina este presente. La cantidad de agregación que genera la ristocetina está relacionada con la concentración del factor de von Willebrand y el porcentaje de actividad¹⁰.

Para el procedimiento del cofactor se realiza diluciones en buffer salino 1:2 del plasma control y 1:4 de las muestras de estudio, se medirá en un agregómetro de las plaquetas activadas usando el buffer y se dejan incubar durante 1 minuto. Posteriormente se añade la ristocetina y después de 45 segundos se añade la muestra de estudio y la muestra control. Si el factor de Von Willebrand está funcionando de manera adecuada la agregación generada se observa como turbidez en el plasma, se volverá a leer en el agregómetro, este generará una curva con el porcentaje y el tiempo que tardaron las plaquetas en agregarse.

Los valores de referencia para pacientes sanos son entre 56% al 187% o dicho de otra manera 56 UI/dl a 187 UI/dl, aunque se recomienda que cada laboratorio realice su valor de referencia según los instrumentos y reactivos utilizados. Por si sola no es una prueba confirmatoria pero si se calcula el índice entre FvW: Ag y FvW: Rco se puede utilizar para la diferenciación de los pacientes que sufren de tipo 1 al tipo 2. si este índice es mayor que 0,7 se relaciona con el tipo 1 y al contrario si es menor se asocia con el tipo 2¹⁹.

Junto con las demás pruebas también se puede mirar los niveles de factor VIII, ya que el factor de von Willebrand tiene un papel crucial en la adhesión plaquetaria y actúa como portador del factor VIII evitando así que se degrade este último. La medición del factor VIII es fundamental para el diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand, ya que están estrechamente interconectados. En condiciones normales el FvW estabiliza al FVIII prolongando así la vida vida en la circulación. Pero sin embargo si hay una deficiencia del factor de von willebrand el factor VIII también se verá disminuido y la cascada de coagulación se verá afectada.

Para realizar las pruebas de evaluación del factor VIII se realizan mediante la prueba de TTPa o un ensayo cromogénico. La prueba del ensayo cromogénico se divide en dos fases, para la primera se simula la cascada de coagulación en sistemas in vitro. Se incuban los factores IX, X, calcio y fosfolípidos con la muestra de interés. Si el factor VIII está en la muestra, el factor X se activa. En la segunda etapa se cuantifica el factor X activado mediante un sustrato cromogénico que este se podrá leer mediante espectrofotometría. Dado que el factor VIII es proporcional a la absorbancia obtenida.

Generalmente se opta por un ensayo de este tipo ya que es de alta especificidad evaluando de manera directa la función de FVIII. También es una prueba que se considera útil en casos de sospecha de enfermedad de von Willebrand, por la asociación que tienen los dos factores²⁴.

Los pacientes con tipo 3 pueden tener una deficiencia de FVIII menor al 10, la cual es la más grave de todas. A diferencia de los subtipos 2A, 2B y 2M donde aparece una leve disminución pero se puede clasificar como ⁹⁹normal. En el caso del subtipo 2N el nivel de FvW es normal pero para FVIII es de nivel bajo.

La prueba de agregación plaquetaria inducida por ristocetina (RIPA) es una prueba fundamental para la evaluación del factor de von Willebrand, especialmente en la sospecha del subtipo 2B. El fundamento de

El procedimiento para realizar esta prueba se hace mediante un agregómetro, para esto se necesita muestra del paciente que sea plasma rico en plaquetas, que se obtiene mediante una ligera centrifugación y el diluyente que será plasma pobre en plaquetas de mismo paciente.

Una vez preparada la dilución entre plasma rico en plaquetas con el plasma pobre en plaquetas o el PRP, se añade la ristocetina en diferentes concentraciones, con el objetivo de determinar cuál es la menor concentración donde al menos el 30% de las plaquetas se agreguen. La actividad normal se considera entre un 0,8 mg/ml a 1,2 mg/ml.

Cuando la actividad del FVW en el plasma es alta o normal (150 UI/dL), se necesita una menor concentración de ristocetina (0,8 mg/mL) para inducir la agregación plaquetaria. Esto se debe a que hay suficiente FVW funcional disponible para unirse rápidamente a las plaquetas y permitir su adhesión. Por el contrario, cuando la actividad del FVW está disminuida (50 UI/dL), se requiere una mayor concentración de ristocetina (1,2 mg/mL) para alcanzar el mismo efecto de agregación. En este caso, al haber menos FVW funcional disponible, es necesario una mayor cantidad de ristocetina para que se logre la interacción suficiente entre el FVW y las plaquetas.

Una agregación plaquetaria con concentraciones muy bajas de ristocetina es indicativo de una hiperafinidad patológica entre el FvW y el receptor plaquetario, cosa que es característico del subtipo 2B¹⁰.

La prueba de para el estudio de los multímeros se realiza mediante una electroforesis en gel poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, es una parte importante en el diagnóstico de FvW. Mediante esta prueba se puede analizar el perfil multimérico, además que se puede analizar de manera cualitativa y cuantitativa. Se puede usar para diferenciar entre tipos de EvW, como son el 2A y 2B. No obstante es una prueba que no se realiza en todos los laboratorios, ya que puede tener una difícil estandarización²¹.

La electroforesis es una técnica para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función del tamaño de estas, se usa una corriente eléctrica para mover las moléculas a través del gel. Para la comparación de las muestras de interés se agregan carriles de control con moléculas conocidas.

La prueba de electroforesis para el factor de von Willebrand es una técnica para evaluar la composición numérica, se hace sobre un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Las muestras se cargan en el gel diluidas en buffer de transferencia, siendo que en el primer carril se deja la muestra control. Se realiza la electroforesis a un voltaje constante para que las moléculas migren adecuadamente. Los multímeros se transfieren a una membrana para la detección, posteriormente se incuban las membranas con el anticuerpo primario anti FvW, seguido del anticuerpo secundario con fosfatasa alcalina. Por último se tiñe mediante un sustrato adecuado para la visualización de las bandas. (²⁰).

El factor de von Willebrand es un proteína de un gen localizado en el brazo corto del cromosoma 22, formado por 741 aminoácidos que forman el pro péptido, que al final de su maduración tendrá 2050 aminoácidos que conformarán la proteína madura.

Aunque hay variantes que causan EvW, los estudios genéticos nos dan información de las mutaciones que sufren los pacientes. Una de las mutaciones más conocidas es R1374C que está asociada al tipo 1 y subtipos 2A y 2M. Los beneficios de los estudios genéticos está relacionado con las familias que sufren del tipo 3, ya que este es el tipo con más complicaciones y síntomas más graves padecen, estas personas pueden solicitar diagnósticos prenatales¹⁰.

El proceso para realizar una prueba genética parte de extracción de sangre venosa recogida en un tubo con anticoagulante de citrato. Una vez la muestra está recogida se realiza la extracción del ADN genómico de los leucocitos utilizando protocolos estandarizados para extracción de ADN. Posterior a esto se debe de evaluar la cantidad y calidad del material genético, paso imprescindible para ampliar de manera específica la región de interés.

El gen del factor de von Willebrand es de gran tamaño ya que está compuesto por 52 exones. Para el análisis de este se realiza la reacción en cadena de la polimerasa o PCR que permiten amplificar secuencias de interés. Se pueden utilizar dos procedimientos para realizar la secuenciación, el método Sanger o la secuenciación de nueva generación, como norma general se usa el método sanger el los laboratorios clínicos de tamaño más pequeños, y el de nueva generación en laboratorios donde el volumen de trabajo sea mayor, ya que este permite evaluar varios genes simultáneamente.

La PCR o reacción en cadena de la polimerasa es una técnica in vitro que consiste en la amplificación de una secuencia específica del ADN, durante varios ciclos la secuencia de interés se copia. Para esto se usa la actividad enzimática del ADN polimerasa.

Una PCR consta de 3 fases diferenciadas, la primera es la desnaturalización, en esta fase las cadenas de ADN son calentadas y separadas, según la unión de los nucleótidos se necesitará más tiempo, ya que la unión de Guanina y Citosina consta de 3 puentes de hidrógeno frente a los dos puentes de hidrógeno de Adenina y Timina. La segunda fase es la hibridación, una vez las dos cadenas están separadas los primers se alinean en el extremo 3’, en esta fase la temperatura de la reacción es importante ya que si es demasiado alta estos no se unirán y si en cambio es demasiado baja pueden unirse a zonas no deseadas generando una reacción inespecífica. En la tercera y última fase es donde los primers van agregando los nucleótidos complementarios hasta generar una copia idéntica a la cadena de ADN molde²³.

Una vez obtenida la secuencia del paciente, se procede con la identificación se pueden identificar mutaciones, como son las inserciones o deleciones. La interpretación de estas mutaciones se realiza con los criterios establecidos por la American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) y la Association of Clinical Genomic Science (ACGS)²².

Las mutaciones según la variante del factor de von willebrand se pueden distinguir por el tipo del FvW que se padezca, las mutaciones asociadas al tipo 1 tienen dos mecanismo responsables, el primero con el Ag está alto y los niveles de desmopresina son insuficientes. Y el segundo es una disminución del factor de von Willebrand en el torrente sanguíneo. Solo se han descrito un 35% de pacientes con tipo 1 con una mutación conocida.

En cambio el tipo 2 al tener diferentes subtipos estos están más estudiados, para el subtipo 2A las mutaciones más conocidas son el missense, deleciones o inserciones que cambian la proteína parcialmente. El 73% de estas mutaciones se localizan en el exón 28, siendo que el 90% de las mutaciones son missense, que pueden tener carácter dominante o recesivo. En el caso de 2M las mutaciones son dominantes, el 75% de estas están localizadas en el dominio A1 en el exón 28 lo que hace que la región de las plaquetas para la unión del factor de von willebrand no actúe de manera adecuada. Para el subtipo 2B se han identificado 25 mutaciones todas de carácter missense, la cual tiene una herencia dominante. Las mutaciones que se encuentran de manera más frecuente son p.R1306W p.R1308C, R1341Q, p.V1316M, siendo la última la más estudiada. Las mutaciones asociadas al subtipo 2N tienen herencia recesiva, para esto se necesitan mutaciones homocigotas, sin embargo la mutación p.R854Q genera este subtipo del factor de von Willebrand. Se ha visto que se generan mutaciones en los exones del 17 al 27, aunque la mayor parte se localizan del 18 al 24, siendo este un 85%.

Las mutaciones asociadas al tipo 3 son más complicadas de realizar, ya que estas mutaciones se pueden localizar por todo el gen, siendo más costosas de realizar. Estas mutaciones se caracterizan por ser homocigotas o heterocigotas compuestas, aunque también se han visto mutaciones de carácter non-sense⁴.

Tratamiento:

El objetivo del tratamiento para el factor de von willebrand se basa en corregir el defecto de la hemostasia, en el caso de la hemostasia primaria se centra en adhesión y agregación plaquetaria, y en el caso de la secundaria los defectos de esta. Principalmente estos tratamientos se centran en la corrección de las hemorragias una vez están estas en marcha o en la prevención si se sabe que el paciente se va a someter a cirugías.

Las terapias incluyen el uso de desmopresina, que liberan FVW las células endoteliales y el FVW exógeno de los concentrados derivados de plasma de FVW/FVIII. Con esto se consigue incrementar los niveles de FVW, por lo que previenen eventos hemorrágicos severos.

La Desmopresina o DDAVP es un derivado sintético de la hormona antidiurética que sube las concentraciones plasmáticas de FVW y FVII. Puede que este efecto se de por la activación del endotelio vascular, que libera el FVW desde sus zonas de almacenamiento y mejora los niveles de FVII al evitar su degradación. El FVW Y EL FVII aumentan de 3 a 5 veces por encima de los niveles basales cuando se inyecta DDAVP por vía intravenosa, subcutánea o intranasal. La dosis intravenosa es de 0,3-0,4 µg/kg, siendo el máximo 20 µg. Se administra diluida en 50 a 100 ml de solución de NaCl al 0,9 % en 20 a 30 min. Por vía intranasal la dosis recomendada es de 150 a 300 µg.

Los pacientes con la enfermedad de Von Willebrand tipo 1 responden mejor al tratamiento con DDAVP. En el tipo 2, la respuesta depende del defecto congénito específico. En el subtipo 2A, se requiere realizar una prueba terapéutica con DDAVP, ya que aunque se libera el factor de Von Willebrand, este contiene multímeros de alto peso molecular que no funciona correctamente. En el subtipo 2B, el uso de DDAVP está contraindicado debido a la trombocitopenia causada por la agregación plaquetaria. En el 2M, la respuesta es generalmente débil, debido a una alteración en el receptor de unión a la plaqueta. Por otro lado, en el subtipo 2N se observa un aumento temporal del FVIII, ya que este no puede estabilizarse por el factor de Von Willebrand, debido a una mutación en el sitio de unión. Finalmente, en el tipo 3 de la enfermedad, no se produce factor de Von Willebrand endógeno, por lo que el DDAVP no tiene ningún efecto terapéutico.

Se debe utilizar cuando los pacientes vayan a someterse a procedimientos con riesgo de sangrado leve a moderado. De igual manera, se encuentra indicado en pacientes con sangrado menstrual excesivo o epistaxis. Se debe tener en cuenta los posibles efectos adversos como la cefalea, el enrojecimiento facial y la hiponatremia, la cual se debe prevenir evitando la ingesta de líquidos posterior a la aplicación del tratamiento. Para la dosis se tendrá que tener en cuenta el peso del paciente, el tipo y la gravedad de los síntomas¹⁰.

 

CONCLUSIÓN

La enfermedad de von Willebrand es el trastorno hemorrágico hereditario más común, causado por la deficiencia o disfunción del factor de von Willebrand, una glicoproteína esencial para la hemostasia. Su diagnóstico requiere la combinación de pruebas de laboratorio que evalúan concentración, funcionalidad y multímeros del factor, así como la actividad del factor VIII. Una correcta interpretación de los resultados, considerando factores biológicos y preanalíticos, es clave para clasificar los diferentes tipos de la enfermedad y orientar un tratamiento eficaz e individualizado.

 

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