Detección de mutaciones en el gen dpyd para pacientes en tratamientos con fluoropirimidinas.

AUTORES

1. Eva Melendo Lapuente. Técnico Superior de diagnóstico clínico en Hospital Miguel Servet, Zaragoza.
2. Beatriz Forcen Lostao. Técnico Superior de diagnóstico clínico en Hospital Clínico Lozano Blesa, Zaragoza.
3. Beatriz Gilaberte Angós. Técnico Superior de diagnóstico clínico en Hospital Miguel Servet, Zaragoza.
4. Sara Borao Pérez. Técnico Superior de diagnóstico clínico en Hospital Clínico Lozano Blesa, Zaragoza.
5. Esmeralda Álvarez Navarro. Técnico Superior de diagnóstico clínico en Hospital Miguel Servet de Zaragoza.
6. Patricia Alcalde Rami. Técnico Superior de diagnóstico clínico en Hospital Miguel Servet, Zaragoza.

RESUMEN

Las fluoropirimidinas son un grupo de agentes citostáticos empleados en el tratamiento de cáncer, como el 5-fluorouracilo (5-FU). El 5-FU es un agente quimioterapéutico usado en tratamientos de distintos tipos de cáncer, como el cáncer de mama, colorrectal, de estómago o pancreático. Es metabolizado por la enzima dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD), que es codificada por el gen DPYD. Existen mutaciones de dicho gen que pueden afectar a la actividad de la enzima, acrecentando así el riesgo de toxicidad 5-FU severo o mortal en estos pacientes, de forma que la detección de deficiencias de DPD nos va a ayudar en un pronóstico más preciso de la toxicidad y de su respuesta quimioterapéutica.

PALABRAS CLAVE

Laboratorios, farmacogenética, DPYD, fluoropirimidinas.

ABSTRACT
Fluoropyrimidines are a group of cytostatic agents used in the treatment of cancer such as 5-fluorouracil (5-FU). 5-fluorouracil (5-FU) is a chemotherapy agent used to treat different types of cancers, including breast, colorectal, stomach and pancreatic cancer. 5-FU is metabolized by the dihydropyrimidine dehydrogenase enzyme (DPD) which is cobed by the DPYD gene. Several mutations within DPYD can affect enzymatic activity, increasing the risk of serious or fatal 5-FU toxicity in these patients, therefore, implementation of DPD deficiency screening by genotyping will allow a more accurate prediction of toxicity and chemotherapeutic response.

KEY WORDS

Laboratories, pharmacogenetics, DPYD, fluoropyrimidines.

INTRODUCCIÓN

La farmacogenética estudia las interacciones que dan los fármacos en las personas en función de sus genes, es decir, la diferente respuesta que cada una tendrá ante un mismo fármaco según los polimorfismos de su ADN.¹

Todas las personas somos diferentes a nivel del ADN, ya que cada persona tiene pequeñas diferencias en los genes que codifican las enzimas. El gen DPYD es la parte del ADN que da las instrucciones para que funcionen las enzimas², por lo tanto es necesario el estudio del ADN para encontrar las diferencias que nos permitan predecir cómo de bien funcionará la enzima DPYD, ayudando así al facultativo especialista en oncología junto con el de farmacia a elegir la dosis o el tipo de medicamento correcto.

La farmacogenética junto con el estudio de las variaciones de la secuencia de ADN sobre la respuesta a fármacos, ayuda a la personalización de los tratamientos oncológicos, puesto que hay un pequeño margen terapéutico y una gran variabilidad en la respuesta de los individuos. Es necesaria para evitar toxicidad y verificar una eficacia de los tratamientos.³

Los fármacos de referencia para la mayoría de tratamientos y estudios clínicos son: el 5-FU, el tegafur y la capecitabina, combinados con cisplatino ó oxaliplatino, en primera línea, siendo el más usado en la actualidad el 5-FU.

El efecto antitumoral del 5-FU se ha relacionado con tres de sus metabolitos: La 5-fluorouridina-2’-deoxiuridina-5’-trifosfato (FdUTP 2), la 5-fluorouridina-5’-trifosfato (FUTP 3) y la 5-fluoro-2’-deoxiuridina-5’-monofosfato (FdUMP). Una vez entra en sangre, más del 80% del fármaco administrado es metabolizado rápidamente en el hígado por la enzima dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) y convertido al metabolito farmacológicamente inactivo 5-fluorodihidrouracilo (DHFU). Si existe deficiencia o inactividad completa de la enzima DPD por causa de mutaciones en el gen DPYD del paciente, es cuando se produce la toxicidad del fármaco ( en torno a un 15% de los pacientes que se les administra 5-FU). A partir de la evidencia clínica y molecular se ha propuesto a la enzima DPYD junto con la enzima TS, como las principales determinantes de la farmacocinética, la toxicidad clínica y la resistencia frente al 5-FU.⁴

OBJETIVO

El objetivo principal es la detección de las mutaciones más frecuentes que afecten al gen DPYD y por tanto a la actividad enzimática de la DPD, en el laboratorio de genética, para los pacientes con tratamientos oncológicos con fluoropirimidinas (mayormente con 5-FU), con el fin de disminuir así la probabilidad de sufrir toxicidad y las reacciones adversas que conllevan.

METODOLOGÍA

La información de este artículo se ha investigado en bases de datos científicas como Scielo y en artículos de revistas científico-sanitarias.

Como buscador se ha utilizado Google Académico.

RESULTADOS

Para obtener unos resultados precisos, realizamos las pruebas mediante secuenciación del ADN, determinando así el orden de los nucleótidos en un oligonucleótido de ADN.

Los dos protocolos clásicos de secuenciación, el método químico y el enzimático comparten etapas comunes: una de marcado, que señala las moléculas a secuenciar, radiactiva o fluorescentemente, y la de separación, que crea una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas, cuyos tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas se pueden separar por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, apareciendo como una escalera de bandas (la longitud varía en un único nucleótido).

– El método químico de Maxam y Gilbert consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases, los productos de estas se solventan, por electroforesis, en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas conseguidas.

– El método enzimático de Sanger necesita disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o «primer» complementario de una región del ADN molde anterior donde se va a iniciar la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I, que va a extender la cadena, copiando de forma complementaria el molde de ADN.

Una alternativa al método enzimático Sanger, es la secuenciación automática empleando el método enzimático, que consiste en marcar un oligo cebador o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia. Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforesis al pasar por delante de un láser, que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida.

Existen otras opciones de secuenciadores automáticos, unos basados en la polimerización un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados sobre un cassette donde se cargarán las muestras y los de capilares, donde el gel de acrilamida ha sido sustituido por un polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la muestra de secuenciación (utilizado para lecturas no superiores a unos 450pb).⁵

Antes de la lectura en el secuenciador, se realizan los siguientes pasos para la correcta preparación del ADN:

-En primer lugar, la muestra del paciente debe ser enviada siempre antes del inicio de su tratamiento, una vez recepcionada en la pre-analítica del laboratorio de genética, se extrae el ADN de un tubo de sangre con EDTA y se mide la concentración y pureza del ADN extraído, para corresponder que sea óptimo y para su posterior dilución a la concentración correspondiente que exige el kit (que detecta las 6 mutaciones fuertemente asociadas con la deficiencia de DPD y es rápido y sencillo).

– A continuación, se realiza un mix de los reactivos con la muestra del paciente, se introduce en un termociclador (reacción en cadena de la polimerasa -PCR) para obtener un gran número de copias del gen DPYD en cada una de las mixes y se desnaturaliza, antes de meterlo al secuenciador.

La técnica completa, tiene una duración aproximada entre 5-6 horas y nos permite distinguir los pacientes homocigotos y heterocigotos para las 6 mutaciones, los resultados serán valorados por un médico encargado de dar un diagnóstico:

• ACTIVIDAD NORMAL DEL DPYD (sin mutaciones): los pacientes tienen enzimas DPYD que funcionan normalmente, por lo cual, no es necesario cambiar las dosis de fluoropirimidinas.
• ACTIVIDAD BAJA DEL DPYD (mutación heterocigota): hay un gen de actividad normal y una copia del gen DPYD inactivo. Estos pacientes tienen una función de la enzima DPYD de 30 a 70 por ciento menor, en comparación con los pacientes con función normal de DPYD. Es recomendable recetar otro medicamento para evitar los efectos secundarios o reducir la dosis de fluoropirimidinas.
• ACTIVIDAD DEFICIENTE DEL DPYD (mutación homocigota): las dos copias del gen no están activas, por lo que no hay ninguna enzima DPYD normal. Los pacientes tienen un alto riesgo de presentar efectos secundarios graves e incluso mortales, por lo que no se recomienda en ningún caso, medicamentos como el 5-fluorouracil o la capecitabina.

CONCLUSIÓN

Gracias a la farmacogenética podemos prevenir los efectos adversos que pueden ocasionar la toxicidad de los fármacos quimioterapéuticos, con métodos sencillos, rápidos y asequibles.

BIBLIOGRAFÍA

1. Morán González D, Jiménez Cabrera S, Domínguez-Gil Hurlé A . Farmacogenética en oncología, ELSEVIER. Volume 131, Issue 5, July 2008, Pages 184-195. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0025775308716403
2. St. Jude Children’s Research Hospital. El DPYD Y LOS MEDICAMENTOS, ALSAC. USA. Revisado en julio de 2017 .Disponible en: https://www.stjude.org/content/dam/es_LA/shared/www/do-you-know-spanish/pharmaco-dpyd-spa.pdf
3. González Bertolín, B.  La farmacogenética como herramienta en el tratamiento de enfermedades oncológicas. Trabajo Fin de Grado 02 Oct 2019, página 2-10 . Disponible en : https://eprints.ucm.es/id/eprint/56374/
4. Castro-Rojas C, Ortiz-López^, R, Rojas-Martínez A. Farmacogenómica del tratamiento de primera línea en el cáncer gástrico: avances en la identificación de los biomarcadores genómicos de respuesta clínica. Invest. clín vol.55 nº2 Maracaibo jun. 2014. pages. 186-192 Disponible en: http://ve.scielo.org/scielo.php?pid=S0535-51332014000200009&script=sci_arttext&tlng=pt
5. Dra. Rodríguez Tarduchy G, Santiago Martínez MC. Estudio del ADN. Secuenciación automática de ADN. Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIB – CSIC) disponible en : http://www2.iib.uam.es/seq/tecnicas/biomed1.htm