Las porinas de escherichia coli y su participación en la resistencia antibiótica.

25 febrero 2022

AUTORES

  1. Gemma Jiménez Guerra. FEA Microbiología en Hospital Can Misses (Ibiza, Islas Baleares).

 

RESUMEN

La resistencia antibiótica en las enterobacterias es un problema de actualidad. La fracción proteica de la membrana externa de estas bacterias, en concreto las porinas, es la principal exponente en la investigación actual de cómo aparecen estas resistencias. Las principales porinas de Escherichia coli son OmpC y OmpF pueden tener gran importancia en el tratamiento antibiótico de infecciones por este microorganismo. Las porinas son proteínas en forma de barril con un canal que atraviesan esta membrana, que aparecen en forma de trímeros y pequeñas variaciones en su estructura cristalina o en los residuos de aminoácidos que forman en canal pueden variar enormemente su función de permeabilidad.

Existen antibióticos que por su estructura química y las características que esta le confiere pueden atravesar la membrana lipídica directamente, otros sin embargo necesitan de algún mecanismo para entrar dentro de la célula, y para ello usan las porinas, especialmente OmpF. Las porinas no son un mecanismo que, aunque esté presente esté siempre abierto, se ha estudiado que ciertos estímulos regulan la apertura de su poro, como el potencial de membrana, el pH o las poliamidas.

En este texto se habla de cómo las mutaciones pueden variar las propiedades de las porinas y cómo la presencia de antibióticos en el medio puede producir cambios celulares, de permeabilidad y hasta de funcionalidad.

Se intenta conocer si la expresión en E. coli de un tipo de porina u otra se relaciona con diferentes valores de CMI para un antibiótico dado. También ver el efecto al enfrentar cepas de E. coli productoras de betalactamasas de amplio espectro (BLEE) y otras no BLEE en concentraciones que simulan la farmacocinética humana para ver la relación entre este tipo de betalactamasas, la expresión de las porinas y la susceptibilidad a antibióticos, así como ver la interacción de las porinas en presencia de fluoroquinolonas.

 

PALABRAS CLAVE

Escherichia coli, porinas, antibiótico, betalactamasa de espectro extendido, fluoroquinolona.

 

ABSTRACT

Antibiotic resistance in enterobacteriaceae is a current problem. The protein fraction of the outer membrane of these bacteria, specifically the porins, is the main exponent in current research of how these resistances appear. The main porins of Escherichia coli are OmpC and OmpF and may be of great importance in the antibiotic treatment of infections by this microorganism. Porins are barrel-shaped proteins with a channel that crosses this membrane, which appear as trimers and small variations in their crystal structure or in the amino acid residues that form the channel can greatly vary their permeability function.

There are antibiotics that, due to their chemical structure and the characteristics that this gives them, can cross the lipid membrane directly; others, however, need some mechanism to enter the cell, and for this they use porins, especially OmpF. Porins are not a mechanism that, although present, is always open, it has been studied that certain stimuli regulate the opening of its pore, such as membrane potential, pH or polyamides.

This text talks about how mutations can vary the properties of porins and how the presence of antibiotics in the medium can produce cellular changes, permeability and even functionality.

The aim is to find out if the expression in E. coli of one type of porin or another is related to different MIC values ​​for a given antibiotic. Also see the effect of facing strains of E. coli that produce broad-spectrum beta-lactamases (ESBL) and other non-ESBLs at concentrations that simulate human pharmacokinetics to see the relationship between this type of beta-lactamases, the expression of porins and susceptibility to antibiotics, as well as to see the interaction of porins in the presence of fluoroquinolones.

 

KEY WORDS

Escherichia coli, porins, antibiotics, extended-spectrum beta-lactamase, fluoroquinolone.

 

DESARROLLO DEL TEMA

La resistencia a antibióticos de las bacterias, especialmente las especies de gramnegativas, y más en concreto las enterobacterias, son un problema sanitario muy relevante. La resistencia suele deberse por la reducción del paso de antibiótico a través de la membrana externa, mediante diferentes mecanismos, degradación de la sustancia antibiótica o por aumento del transporte de esta sustancia al exterior celular. Combinando una bicapa lipídica altamente hidrofóbica con proteínas similares a poros con propiedades de exclusión específicas según tamaño, la membrana externa se comporta como una barrera selectiva, excelente frente al paso de moléculas polares.

La superfamilia de las porinas es la que contribuye a la permeabilidad de muchos antibióticos a través de la membrana externa. El paso de antibióticos a través de estas porinas puede producir diferentes efectos en ellas mismas que alteran la sensibilidad a los antibióticos; pueden disminuir la permeabilidad e incluso pueden alterar la regulación de los genes que codifican a las propias porinas por mutaciones selectivas de ciertas cepas bacterianas. Esta presión conduce a una mayor resistencia a costa de una pérdida de la capacidad de acceso de nutrientes. Incluso la resistencia intrínseca a ciertos antibióticos parece reflejar la sinergia de la membrana externa actuando como barrera de permeabilidad. Cualquier cambio de composición en los lípidos o en las porinas de la membrana externa podría influir en los sistemas de flujo, pudiendo incluso resultar determinante.

En este trabajo me voy a centrar principalmente en Escherichia coli, miembro perteneciente a la familia de las enterobacterias. Las porinas OmpF y OmpC son de gran importancia en la membrana externa de E. coli, suman aproximadamente el 2% del total de proteínas de la célula. Muchas cepas de E. coli tienen una expresión reducida de OmpF, de la que se sabe que es uno de los principales mecanismos de entrada de antibióticos a la bacteria.

 

Organización de la membrana externa:

En las bacterias gramnegativas la membrana externa es una bicapa lipídica asimétrica de fosfolípidos y lipopolisacáridos que sólo se encuentra en la capa externa 1. La molécula del lipopolisacárido, como se muestra en la Figura 1, tiene tres partes:

  • Lípido A: fosfolípido glucosaminado.
  • Núcleo de oligosacáridos.
  • Polisacárido distal, también conocido como antígeno O.

Parte del núcleo de oligosacáridos y el antígeno O no son fundamentales para el crecimiento bacteriano.

La composición fosfolipídica de la capa interna de la bicapa es similar a la de la membrana citoplasmática:

  • 80% fosfatidiletanolamina.
  • 15% fosfatidilglicerol.
  • 5% cardiolipina.

En la membrana externa hay una gran variedad de proteínas, como la mureína, OmpA y porinas de difusión general. La mureína porta un fragmento ácido graso que se ancla en la membrana externa y a su vez, además, un tercio de las mureínas presentes en la célula mantienen un enlace covalente con la capa de peptidoglicano, con lo que se le supone una función de mantenimiento de la integridad de la membrana externa. Aquellas células carentes de mureína producen vesículas de membrana externa y no poseen enzimas periplasmáticas.

La OmpA tiene una función estructural, y si esta proteína falta junto con la mureína, la célula pierde su forma normal. En Pseudomonas aeruginosa la proteína OprF es homóloga a OmpA, y tiene propiedades de porina, aunque con una capacidad de permeabilización muy baja, a partir de esto se sugirió que estas proteínas podrían tener diferentes propiedades según su conformación: una forma de presentación monomérica con dominio terminal C periplasmático con función estructural y una forma oligomérica, en menor cantidad, que funciona cómo porina.

También existen proteínas con función de canales especializados en la membrana externa y receptores para sustratos específicos, proteínas con función de regeneración de la membrana externa, traslaciones que permiten la liberación de las sustancias secretadas, enzimas, y proteínas que participan en el ensamblaje del lipopolisacárido.

 

Estructura de las porinas:

La estructura cristalina de OmpF y OmpC es similar, formada por 16 láminas beta anfipáticas en forma de barril con un poro, Figura 2. El tamaño del poro para OmpF es mayor que para OmpC, con lo cual OmpF permite una mayor difusión de solutos dentro de la célula, entre ellos, agentes dañinos para la bacteria. Las láminas están conectadas mediante 8 largos bucles extracelulares (L1 a L8 de 9-30 residuos de longitud) y mediante 8 cortos giros periplásmicos (2 – 8 residuos de longitud). El dominio extracelular es un sitio de interacción, como receptor, para colicinas específicas y fagos. Estas proteínas se pueden encontrar como trímeros que permanecen juntos mediante interacciones hidrófobas entre la superficie de la estructura en barril y el ácido glutámico del bucle L2. Cada uno de los tres bucles L2 del trímero alcanza al monómero adyacente formando un puente salino (enlace no covalente) entre el ácido glutámico del bucle L2 y una arginina que se encuentra dentro de la estructura en forma de barril. L3 se pliega dentro del poro y produce una estrechez sobre la mitad de este, como se observa en la Figura 2, formando una zona de constricción que es la que determina el diámetro efectivo del poro.

 

La barrera lipídica de la membrana externa:

Resistencia a antibióticos mediada por lípidos.

Los antibióticos hidrofóbicos pueden penetrar en la célula a través de bicapa de la membrana externa, como ocurre con los aminoglucósidos, los macrólidos, las rifamicinas, la novobiocina, el ácido fusídico y los péptidos catiónicos. Las tetraciclinas y las quinolonas pueden usar tanto las porinas para entrar a la célula, así como atravesar la bicapa.

El núcleo del lipopolisacárido tiene una importante función como barrera para los antibióticos y otros compuestos también hidrofóbicos, de modo que las cepas bacterianas que expresan un lipopolisacárido de gran longitud son intrínsecamente resistentes a los antibióticos hidrofóbicos.

Existen sustancias permeabilizadoras de la membrana como son el Tris/EDTA, la polimixina B y la polimixina B de nueve péptidos (PMBN) que pueden aumentar la sensibilidad a antibióticos hidrofóbicos en bacterias como E. coli y Salmonella typhimurium. Pero de estos dos microorganismos también se han aislado cepas mutantes resistentes a la permeabilización con polimixina B.

Permeabilidad mediada por porinas:

Las propiedades funcionales de las porinas son estudiadas desde hace más de 30 años. Los primeros trabajos se encargaban de determinar el tamaño de las moléculas que podrían atravesarlas. Para OmpF se determinó un tamaño de 600 Da, que incluía iones, aminoácidos y pequeñas moléculas de azúcares. Moléculas de mayor tamaño necesitaban transportadores específicos.

También se ha usado la electrofisiología tradicional para estudiar las corrientes iónicas mediadas por porinas en bicapas lipídicas planares, también llamadas “black lipid membranes” (BLM). La bicapa lipídica se forma a través de una apertura situada en una lámina de teflón que separa dos cámaras, y cada una de estas cámaras contiene una solución iónica tamponada y un electrodo para medir la corriente eléctrica a través de la bicapa y regular la intensidad necesaria para que se dé el flujo iónico. Proteínas con función de canal, purificadas y solubilizadas en detergente son añadidas a una de las cámaras (cámara cis) e insertadas en la bicapa. La inserción secuencial de canales abiertos en la membrana permite en pequeña cantidad el movimiento de iones a través de ellos. La conductancia de un canal se puede obtener midiendo los pequeños saltos que se dan en el movimiento de iones a través de los canales abiertos. Las porinas se añaden como trímeros a esta bicapa, por lo cual la medición de su conductancia corresponde a la estructura trimérica. Alterando la concentración de canales en la bicapa es posible conseguir insertar una sola unidad o trímero o varios de ellos, con lo que realmente se puede estudiar la conductancia de un solo canal o la de una población de canales.

Los grupos de investigación de Benz y Rosenbusch 2-5 realizaron estudios durante las décadas de los 70 y de los 80 que establecen algunas de las propiedades de las porinas como un mayor flujo iónico a mayor tamaño del poro, la baja selección iónica (aunque existen porinas que tienen preferencia por los aniones, y otras cationes, como OmpC), y la gran probabilidad de permanecer abiertos los canales en condiciones de bajo voltaje en estudios de electrofisiología, a pH neutro y a alta carga iónica. La preferencia de OmpF por cationes con respecto a los aniones aumenta de forma brusca en soluciones con baja carga iónica, alcanzando casi una absoluta selectividad por cationes en soluciones de <100mM KCl. Sin embargo, a un pH <4 los canales son capaces de cambiar su preferencia hacia los aniones. Mutaciones de un solo nucleótido pueden producir cambios en la preferencia de iones. Un cambio en el residuo D113 de OmpF que está expuesto al canal, así como en sus homólogos en OmpC y en OmpU de Vibrio cholerae disminuyen la preferencia por cationes.

Este tipo de mutaciones de un solo nucleótido pueden afectar a la conductancia, que no sólo está en relación con el tamaño del poro, sino que también está influenciada por la interacción de los iones penetrando por los canales, por lo que no ha de pensarse que un mayor tamaño de poro siempre se acompaña de una mayor conductancia o del paso de sustancias de mayor peso molecular.

 

La regulación de las porinas. Importancia del sistema de dos componentes:

La compleja regulación de los estímulos externos se lleva a cabo también mediante una compleja red que incluye diversos mecanismos: sistemas de 2 componentes como EnvZ/OmpR y CpxA/CpxR, el ARNs MicF y MicC, los factores sigma ơS y ơE, el regulador global Lpr y la proteína histona-like IHF.

Un sistema de dos componentes (TCS) es un sistema de regulación global con gran importancia en la respuesta bacteriana a diversos factores ambientales, ver la Figura 3. Hay más de 4000 TCS identificados y clasificados desde 1984 en 145 especies bacterianas. Los sistemas de dos componentes están formados por:

  • HK: Una histidina-quinasa en la membrana interna que actúa como sensor del factor ambiental.
  • RR: Un regulador de respuesta citoplasmático.

HK transforma el estímulo externo en una señal por la autofosforilación de los residuos conservados de histidina, y luego se transfiere el grupo fosforilado a un residuo de ácido aspártico del RR activándolo. Entonces el RR activado regula la transcripción y expresión de genes para adaptar la bacteria al estímulo que desencadenó la señal, que puede ser cambio en el pH, iones, nutrientes, cambios en la osmolaridad o presencia de un antibiótico.

Los TCS se relacionan con la resistencia antibiótica ya que activan los sistemas de bombas de flujo alterando la permeabilidad de la membrana externa. Hay dos TCS que regulan la expresión de OmpC y OmpF en condiciones de aerobiosis, y son EnvZ/OmpR y CpxA/CpxR. Realmente el recuento total de OmpC y OmpF en la célula permanece constante dentro de unos límites en la membrana externa de E. coli, y estas porinas pueden variar un poco en respuesta a los cambios en el ambiente. El sistema de dos componentes EnvZ/OmpR es el principal regulador de estas porinas. En un medio con alta osmolaridad o pH ácido, OmpR se fosforila por la activación de EnvZ y los niveles de OmpC y OmpF varían para adecuar la homeostasis a la situación actual. Bajos niveles de OmpR fosforilada activan la transcripción de ompF, mientras que altos niveles de OmpR fosforilada producen una represión de ompF y activan ompC, como podemos ver esquemáticamente en la Figura 3. Hay estudios en los que se muestra que OmpR se une a tres lugares del promotor de ompC que se designan como C1, C2 y C3, y a cuatro lugares del promotor de ompF, uno de ellos distal que es F4 y tres proximales, siendo F1, F2 y F3. Pero realmente el mecanismo subyacente de la diferente regulación de ompF y ompC por parte de OmpR no es del todo conocido.

El otro sistema de dos componentes que participa en la regulación de las porinas es el CpxA/CpxR, que responde a situaciones de pH alcalino y sobreproducción de proteínas de secreción, aunque también tiene participación en la fijación de células a superficies. Una sobreexpresión de OmpF y OmpC no es la que activa este sistema, sino que ocurre cuando hay un gran descenso de la expresión de ompF junto con un aumento de la expresión de ompC. CpxR fosforilado actúa directamente sobre los promotores de ompF y ompC, disminuyendo OmpF y aumentando OmpC. Los sistemas de dos componentes que actúan en regulación de porinas, EnvZ/OmpR y CpxA/CpxR, convergen en los promotores de los genes de las porinas.

Se pensaba que las porinas eran un mecanismo que permanecía permanentemente abierto, y durante años se creía que el único mecanismo por el que se reducía la permeabilidad mediada por porinas era mediante la disminución de la expresión de las porinas debido a factores ambientales o mutaciones.

Es importante saber qué factores permiten el cierre rápido de porinas, pues el estrechamiento de ellas disminuye la eficacia de los antibióticos en la penetración celular. El primero de estos mecanismos que se describió fue el voltaje transmembrana, aunque su importancia a veces se ve disminuida, pues se cree que la membrana externa no tiene potencial transmembrana. Pero está claramente visto que existe la inactivación de las porinas mediante el voltaje, que del mismo modo puede afectarse por mutaciones de residuos específicos del poro.

La sensibilidad al voltaje de las porinas se cuantifica típicamente por el valor de potencial “threefold” (“tres veces, puesto que se trata de un trímero) que es el mínimo potencial de membrana con el que las porinas comienzan a cerrarse, por encima de este valor los monómeros se cierran de forma secuencial. El potencial “threefold” tiene un valor cercano a 150 mV para OmpF y a 200 mV para OmpC, pero también existen porinas que actúan a un potencial más bajo.

Aunque esto debería demostrarse de forma experimental, ocurre que OmpF podría cerrarse in vivo cuando hay un potencial de membrana opuesto, es decir más positivo en el espacio periplasmático que en el exterior. Esto se puede lograr in vivo estableciendo un gradiente de concentración de iones de potasio en el rango en el que ya hemos dicho que OmpF se vuelve más selectivo para cationes (<100 mM KCl).

Cuando el pH es inferior a 4, aparece un cierre y apertura rápidos de los canales que se atribuye a fenómenos de protonación y de deprotonación de ciertos residuos ácidos en el poro. En un pH ácido se aumenta la probabilidad de que se cierren las porinas. Los bucles extracelulares L1, L7 y L8 de OmpF podrían estar implicados en el cierre de porinas debido a cambios conformacionales inducidos por pH ácido. Estos bucles forman una especie de tapa que podría cerrar el poro desde el exterior.

La poliaminas son moléculas de naturaleza catiónica y carácter básico capaces de inhibir OmpF y OmpC, son la espermina, la espermina y la cadaverina. Parece ser que estas moléculas se unen a una zona interna del canal y lo cierran. Para la espermina el lugar de unión parece ser los residuos ácidos D113 y D121 del bucle L3. Esto tiene una gran importancia terapéutica en el tratamiento de infecciones de localizaciones ricas en espermina, como son las prostatitis. E. coli puede producir endógenamente cadaverina y secretarla a pH ácido. La modulación hacia una menor expresión de porinas por parte de la cadaverina es una respuesta adaptativa a una posible caída del pH.

 

La entrada de moléculas a través de las porinas:

Las moléculas con estructura de zwitterion son aquellas cuya estructura química es eléctricamente neutra, pero tiene cargas formalmente positivas y negativas sobre átomos diferentes, es decir, son polares y muy solubles en agua. Existen antibióticos con estructura química de zwitterion que tienden a unirse a la entrada del poro e interactuar con los residuos con carga, lo que facilita su translocación.

Se ha visto que existe el bloqueo de la porina OmpC por la presencia varios antibióticos con estructura zwitteriónica altas concentraciones, previa a su translocación. Mutaciones de los residuos con carga eléctrica que se encuentran dentro del poro pueden causar resistencias a antibióticos, más que por cambio en el diámetro del poro, por alteración de los enlaces de hidrógeno que interaccionan con las cargas.

 

La capacidad de OmpC mutantes de alterar el transporte en E. coli:

Se han hecho estudios que combinaban el estudio de la estructura biológica de las porinas y estudios in silico para investigar el mecanismo por el cual las mutaciones de las porinas participan a la aparición de resistencias antibióticas, en los que los datos arrojan un modelo en el que la alteración del campo electrostático transverso en el poro creado por los residuos cargados es el factor que más influye en el transporte de antibióticos.

En un estudio se quiso estudiar si la función de la OmpC tenía capacidad para alterar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de varios antibióticos a partir de varios aislamientos de origen clínico6. Estos aislados se transformaron con un plásmido que permitía la expresión de fenotipo OmpC K12 (cuya secuencia génica difiere ligeramente de la del gen de la proteína OmpC20 aislado de la cepa original, permitiendo la expresión de OmpC, pero no de OmpF), y en todos ellos se vio una gran disminución de la CMI para cefotaxima e imipenem, como control se usó la gentamicina que para entrar en la bacteria no requiere porina, en ella la presencia de OmpC K12 no alteró los valores de CMI, como se observa en la Tabla 1. Se infirió que el transporte de antibióticos mediado por OmpC es un factor importante en la resistencia. Para estudiar la certeza de esta afirmación se eligieron 3 cepas isogénicas diferentes con falta de porinas funcionantes: ʌ9Omp, ʌ8Omp y HN705 (cepa inoculada con el plásmido para expresión de OmpC K12). Con estas tres cepas se intentaba aislar los efectos de las tres mutaciones en las porinas de otros factores. Aquellas bacterias que no tenían el plásmido fueron menos sensibles, lo cual estaba de acuerdo con que OmpC podría ser ruta importante de entrada de antibióticos. Y como se esperaba del control con gentamicina, la sensibilidad frente a esta no se vio alterada en ningún momento.

Previo a todo esto, para comprobar la funcionalidad de OmpC en aquellas células que la expresaban, se cultivó las 3 cepas en iguales condiciones en medio LB. La cepa ʌ9Omp falló en su crecimiento, sin embargo, las células que expresaban OmpC crecieron sin problema confirmando la funcionalidad.

En esta misma experiencia también se estudiaron las diferencias estructurales entre la OmpC de la cepa madre (la de los aislados clínicos, OmpC20) y la OmpC K12, y en general la estructura entre ambas se mantiene muy similar. La mayoría de las diferencias, que son de un solo residuo, entre estos dos homólogos se localizan en los bucles extracelulares L2, L4 y L5.

Hay un fragmento de varias substituciones en L2 de OmpC K12, que, a pesar de formar la principal unión del trímero, no afecta a la estructura final. La secuencia de L3 está altamente conservada, con la sola diferencia de que la G116 de la secuencia de OmpC K12 se sustituye por D116 en OmpC20. Las sustituciones de aminoácidos restantes se limitan a varios residuos en las hojas beta en la zona externa de la estructura. Por otro lado, OmpC20 tiene una entrada al poro con mayor carga negativa que OmpC K12.

El poro de la porina se examinó por el sistema HOLE, en el cual se observa el paso de una esfera imaginaria a través del canal de un monómero, y se vio que las mayores diferencias entre OmpC20 y OmpC K12 aparecen en la mitad superior a la zona de constricción del poro, la que da al espacio extracelular, donde el diámetro del canal se reduce 1Ǻ en OmpC20.

En muchos estudios in vitro se han realizado mutaciones en porinas que bloqueaban parcialmente el poro y esto hacía que disminuyese el paso de antibióticos y de pequeños iones. Pero en la práctica clínica sólo se ha observado la mutación en la posición 116 de glicina a aspartato en L3, que ciertamente reduce la permeabilidad de antibióticos e iones por oclusión.

Por otro lado, se ha visto con la ausencia de OmpF que OmpC es vital para la adquisición de nutrientes pero que también es la principal vía de entrada de antibióticos. Una pérdida de la expresión de ompF suele ocurrir en las enterobacterias dentro del organismo humano, y se presupone que ocurre porque OmpC tiene un poro de menor tamaño, es más adecuada para altas cargas iónicas y por lo general es menos permeable a los antibióticos betalactámicos.

La pérdida de ompF hace que aumente la resistencia a norfloxacino, tetraciclinas, cefalotina y cefoxitina; mientras que la pérdida de ompC reduce la acumulación de cefalotina y cefoxitina.

 

Porinas y carbapenemes:

E. coli productor de betalactamasas de espectro ampliado (BLEE) es patógeno frecuente causante de infecciones urinarias en la comunidad, y se ha visto que el ertapenem es un tratamiento efectivo de estas infecciones, por su relación coste-efectividad, así como por poder pautar en una sola dosis parenteral. En las enterobacterias actualmente están aumentando las resistencias a carbapenemes, mediante la reducción de la expresión de porinas.

Hace unos años, se hizo un estudio in vitro en el que se asociaba la producción de BLEE con baja susceptibilidad a los carbapenemes y una alta frecuencia de resistencia a este grupo de antibióticos en subpoblaciones de E. coli. Se vio que había una baja expresión de OmpF y OmpC en aquellas cepas de E. coli resistentes a carbapenemes7. En un estudio de 2013 el objetivo era ver el impacto de la producción de BLEE por E. coli con respecto a la actividad de carbapenemes a concentraciones antibióticas clínicamente relevantes. Tanto cepas productoras como no productoras de BLEE se expusieron al antibiótico en un modelo in vitro que simulaba las concentraciones en el plasma de un paciente tratado. Las poblaciones bacterianas que sobrevivían pasadas 48 horas se examinaban para conocer la resistencia a carbapenemes y las posibles mutaciones que daban lugar a una menor expresión de las principales porinas en E. coli (OmpC y OmpF).

Se seleccionaron dos cepas de E. coli, una nativa no productora de BLEE y una productora de BLEE obtenida de esta tras la conjugación de un plásmido. Las bacterias se sembraron en medio de Mueller-Hinton agar (MH) a 37ºC que se suplementó con tetraciclina 20 mg/l durante el proceso de precultivo para la selección de plásmidos. Las bacterias supervivientes se cultivaron definitivamente en MH a 37ºC durante 24 horas, de nuevo tras un proceso de dilución. Posteriormente las bacterias se expusieron a concentraciones crecientes de ertapenem y se hizo un recuento periódico hasta pasadas 24 horas.

Por último, se enfrentaron a diferentes carbapenemes (ertapenem, meropenem, imipenem y doripenem) para ver si había variaciones en la CMI. La CMI para los antibióticos se determinó mediante E-Test y con resultados por duplicado.

En aquellas cepas productoras de BLEE debido al plásmido la CMI llegaba a ser 1.5-2 veces mayor para ertapenem, meropenem y doripenem con respecto a la cepa no productora, sin embargo, para la CMI de imipenem no había diferencias, como puede observarse en la Tabla 2.

En este estudio se demostró que exponiendo cepas de E. coli productoras de BLEE a ertapenem a concentraciones similares a las de la farmacocinética humana se producía un fenómeno de selección de mutantes con deficiencia de porinas. Sin embargo, no hubo mutantes con una mayor CMI tras la exposición de la cepa nativa.

Se llegó a la conclusión según estas observaciones que la combinación de la producción de BLEE y la pérdida de porinas en E. coli puede desembocar en una disminución de la sensibilidad a ertapenem, como se ha visto que ocurre en otros estudios con K. pneumoniae. Subpoblaciones con pérdida de porinas y susceptibilidad disminuida a los carbapenemes aparecen frecuentemente en E. coli productor de BLEE durante la exposición a ertapenem a concentraciones que simulan la farmacocinética humana. De todas formas, la resistencia a ertapenem en E. coli es poco frecuente y las bacterias con pérdida de porinas de nuestro estudio no mostraron una alta resistencia. El uso inapropiado de ertapenem debe evitarse para minimizar la posible selección de bacterias productoras de BLEE.

 

Porinas y la familia de las fluorquinolonas:

En E. coli la resistencia a las fluoroquinolonas puede deberse a los diferentes mecanismos de resistencia: mutaciones en genes codificantes de enzimas diana, mutaciones en la ADN-girasa y la topoisomerasa IV, resistencia mediada por plásmidos o mediante bombas de flujo. Sin presencia de porinas, junto con sobreexpresión de bombas de flujo expulsivo o no, la susceptibilidad a las fluoroquinolonas se ve disminuida en este microorganismo. Los datos acerca de la comparación de la susceptibilidad entre diferentes fluoroquinolonas en estas condiciones son limitados.

En un estudio se investigó el efecto de un inhibidor de las bombas de flujo externo en la susceptibilidad para ciprofloxacino, enrofloxacino y marbofloxacino en cepas de E. coli resistentes a ciprofloxacino, así como en la expresión de diversos genes, entre ellos ompC y ompF, en cepas de E. coli sensibles a ciprofloxacino8.

Para este trabajo se seleccionaron 34 aislamientos de E. coli; 17 con valores de CMI entre 0.008 y 0.03 ɥg/ml para ciprofloxacino, como sensibles; y 17 con valores de CMI entre 4 y 16 ɥg/ml para el ciprofloxacino que se catalogaron, como resistentes. La sensibilidad a los antibióticos se testó mediante dilución en caldo según recomienda el CLSI, desde 128 a 0.25 ɥg/ml.

El inhibidor de las bombas de flujo es en PAßN (Phe-Arg-ßnaftilamida), que se puso en cada aislamiento de E. coli ciprofloxacino resistente cuya CMI iba a medirse. Para ver el efecto del inhibidor se realizaron los cálculos de un nuevo valor, el factor de disminución de la CMI (FDM), con la siguiente fórmula:

FDM = CMI noInh / CMI Inh.

Mediante PCR cuantitativa también se estudió qué genes codificantes de bombas de flujo y de porinas se expresaban en las cepas resistentes y en las sensibles.

Como se ve en la Tabla 3, las cepas resistentes a ciprofloxacino que estaban tratadas con el inhibidor tenían ahora los siguientes valores de CMI; para ciprofloxacino pasaron de una media de 8 a una media de 4 ɥg/ml, para enrofloxacino pasaron de 16 a 2ɥg/ml, y para marbofloxacino pasaron de 8 a 2 ɥg/ml. En las cepas resistentes a ciprofloxacino de E. coli tratadas con PAßN la susceptibilidad difiere significativamente entre antibióticos, en favor de una mejor diferencia para enrofloxacino y marbofloxacino con respecto ciprofloxacino. Para cada cepa resistente también se calculó el FDM, y comparándolo con la media teórica de la CMI, el FDM aumentaba independientemente del antibiótico, con una p < 0.05.

En las cepas de E. coli sensibles la expresión de ompF fue un 50% menos (p <0.05) con respecto las resistentes, mientras que en las sensibles ompC era un 30% menor que en las resistentes (p < 0.1).

Con este estudio se vio una mayor afinidad de las fluoroquinolonas hidrofóbicas a proteínas relacionadas con la disminución de la susceptibilidad. Tras añadir el inhibidor la CMI disminuyó siempre, independientemente del tipo de fluoroquinolona. Sin embargo, tras este tratamiento con PAßN la sensibilidad para los diferentes antibióticos difería, teniendo un FDM mayor para enrofloxacino si se compara con marbofloxacino y ciprofloxacino.

El descenso en la acumulación celular de antibióticos es un fenómeno complejo que depende de muchos mecanismos, entre ellos las bombas de flujo, la expresión de genes que las codifican, y las porinas. En cuanto a las porinas, los resultados de este estudio demostraron una disminución de la expresión de ompF y ompC en las cepas de E. coli resistentes con respecto a las cepas sensibles. En estudios anteriores a este ya se había visto que en las cepas con CMI elevada había menos OmpF. Los resultados de este estudio apoyan que OmpF es la principal porina que media en la acumulación de fluoroquinolonas en E. coli.

 

Ácido nalidíxico (otra quinolona más), clortetraciclinas y porinas.

En un estudio se evaluó la capacidad de supervivencia en cepas de E. coli mutantes para los genes envZ, ompR, cpxA y cpxR, de forma que estos no eran funcionantes, cuando se expusieron a ácido nalidíxico (NA) y clortetraciclinas (CTC). Estas cepas derivan de una cepa original resistente a ácido nalidíxico y a clortetraciclina9.

Las cepas mutantes se expusieron a las concentraciones de ácido nalidíxico de 1.25, 1.875 y 2.50 ɥg/ml, que equivalen a los valores de CMI de 1/4, 3/8 y 1/2 para la cepa control no mutante de E. coli (que era resistente a clortetraciclina y ácido nalidíxico); y también a concentraciones de 0.78, 1.56 y 3.13 ɥg/ml de clortetraciclina, que corresponden a CMI de 1/8, 1/4 y ½ de la cepa control.

Como se observa en la Figura 4, en respuesta a la exposición a ácido nalidíxico todas las cepas mutantes crecían más lentamente que la cepa control. En las cepas expuestas a clortetraciclina, la cepa mutante deficiente en envZ, creció más rápido que las demás, incluso que la cepa control, su capacidad de supervivencia era mayor, aunque era dosis-dependiente. Esto indica respuestas contrarias de esta cepa frente a la exposición de un antibiótico u otro.

En este estudio se pretendía conocer más acerca de las funciones de OmpC y OmpF en cuanto a la capacidad de supervivencia, así que se evaluó la expresión de estas porinas en presencia de los dos antibióticos mediante un estudio con Western-Blot, ver Tabla 4. No había diferencias significativas en la expresión de OmpC en las mutantes deficientes de cpxA y cpxR. Los cambios en la expresión de la porina se daban en las mutantes deficientes para envZ y ompR, esto sugeriría que la importancia de una diferente expresión para OmpC vendría por el sistema de dos componentes EnvZ/OmpR en la resistencia a NA y CTC. La ausencia de envZ da lugar a un descenso y aumento del crecimiento celular según el antibiótico que concuerda con estudios previos en los que se dice que la función de EnvZ actúa como monitor de los cambios en la concentración de solutos en el exterior. Estos cambios originados por la pérdida de ompR, envZ, cpxR y cpxA refuerzan que las porinas están reguladas por dos sistemas de dos componentes diferentes.

En este mismo trabajo se estudió también la función de otras proteínas relacionadas con estos dos sistemas de dos componentes en E. coli expuesto a NA y CTC usando igualmente cepas mutantes con gen no funcionante para las proteínas estudiadas.

Se han descubierto algunos mecanismos de resistencia que adquieren las bacterias frente a los antibióticos, pero el complejo completo que regula los mecanismos de resistencia es en total muy poco conocido. E. coli tiene diferentes estrategias contra NA y CTC a través de la regulación de unas pocas proteínas en el amplio grupo de proteínas que participan en la regulación, en mayor o menor parte, de los sistemas EnvZ/OmpR y CpxA/CpxR. La eficiencia y la capacidad de esta bacteria de luchar contra los antibióticos se debe al menos en parte a la capacidad de regular de forma específica y eficiente la expresión del grupo de proteínas estudiado.

 

CONCLUSIONES

La resistencia a antibióticos en enterobacterias es un problema sanitario de actualidad, están apareciendo nuevas resistencias antibióticas y debemos estudiar mediante qué mecanismos se producen para prevenirlas. Un amplio campo de estudio en este tema es la participación de las porinas, que son una de las principales vías de entrada de los antibióticos en la bacteria.

Los posibles cambios en los componentes de la membrana externa, tanto en su fracción lipídica como en su fracción proteica pueden dar lugar a resistencias antibióticas. Las principales participantes en la fracción proteica son las porinas, en las cuales, incluso las mutaciones de un solo nucleótido pueden cambiar sus propiedades, aunque no produzcan cambios en su estructura cristalina. La zona de mayor importancia para las mutaciones en las porinas es L3, que da lugar a la zona de constricción dentro del poro.

Las porinas principales de E. coli que son OmpC y OmpF, su expresión se regula principalmente por dos sistemas de dos componentes que son EnvZ/OmpR y CpxA/CpxR. Estos sistemas responden a condiciones ambientales como la osmolaridad y el pH. Las porinas no permanecen constantemente abiertas, el poro se puede cerrar por cambios en el potencial de membrana y por la presencia de poliaminas en el medio.

OmpC representa la principal vía de entrada de antibióticos en E. coli, pero también es fundamental para la adquisición de nutrientes desde el medio. Una baja expresión de OmpC conduce a una menor acumulación intracelular de cefalotina y cefoxitina.

Cuando exponemos una bacteria a un antibiótico se producen fenómenos de selección de cepas mutantes con mecanismos de resistencia para ese antibiótico. Al exponer E. coli productor de BLEE a ertapenem en concentraciones similares a las de la farmacocinética humana se seleccionan mutantes con deficiencia de porinas, que puede conducir a una disminución de la susceptibilidad.

Que haya un descenso en la acumulación de un antibiótico dentro de la bacteria depende en gran parte de las bombas de flujo y la expresión de los genes que la codifican, y también de las porinas. Existen estudios cuyos resultados apoyan que OmpF en E. coli es la principal porina que media en la acumulación de fluoroquinolonas en su interior.

Hay que tener en cuenta que, a pesar de los descubrimientos realizados en los últimos años, la compleja red que regula los mecanismos de resistencia antibiótica en E. coli es muy poco conocida.

Es fundamental hacer un uso responsable de los antibióticos en la práctica clínica para evitar que se sigan aumentando las resistencias. Mediante la investigación de los mecanismos por los que estas resistencias antibióticas se producen se intenta comprender cuál sería la actitud más adecuada para encontrar una solución a la situación actual.

 

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