AUTORES
- María Dolores Fuentes Marín. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- María López Gómez. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- Ana Cristina Miguel Molinos. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- Marta Sabanza Belloso. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- Gabriel Ciprian Negru.Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
- Beatriz Jiménez Moraleda. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
RESUMEN
Chlamydia trachomatis es una bacteria intracelular, con un complejo ciclo biológico, queen humanos causa infecciones oculares y del sistema genitourinario muy diversas (tracoma, linfogranuloma venéreo, uretritis y cervicitis o enfermedad inflamatoria pélvica) que se caracterizan por su tendencia a la cronicidad.
Actualmente, C. trachomatis es una de las causas más frecuentes de Infección de Transmisión Sexual (ITS) en España. Si esta infección no se diagnostica o no se trata adecuadamente pueden aparecer infecciones crónicas y secuelas graves.
El cultivo celular ha sido el principal método para el diagnóstico de infección por Chlamydia trachomatis pero,desde hace varias décadas, ha sido sustituido por otras técnicas más sencillas, rápidas y que permiten una mayor capacidad diagnóstica en el laboratorio de Microbiología.
PALABRAS CLAVE
Chlamydia trachomatis, enfermedades de transmisión sexual, ITS, PCR, inmunoensayo.
ABSTRACT
Chlamydia trachomatis is an intracellular bacterium, with a complex biological cycle, which in humans causes very diverse ocular and genitourinary system infections (trachoma, lymphogranuloma venereum, urethritis and cervicitis or pelvic inflammatory disease) that are characterized by their tendency to chronicity.
Currently, C. trachomatis is one of the most frequent causes of Sexually Transmitted Infection (STI) in Spain. If this infection is not diagnosed or not treated properly, chronic infections and serious sequelae can appear.
Cell culture has been the main method for the diagnosis of Chlamydia trachomatis infection but, for several decades, it has been replaced by other simpler, faster techniques that allow greater diagnostic capacity in the Microbiology laboratory.
KEY WORDS
Chlamydia trachomatis, sexually transmitted diseases, STD,PCR, immunoassay.
INTRODUCCIÓN
Chlamydia trachoma es un microorganismo procariota, de tamaño muy pequeño y morfología esferoidal, que se comporta como parásito intracelular estricto de las células de los vertebrados y que presenta un ciclo de desarrollo intracelular muy característico.1-8
C. trachomatis se encuentra muy difundida entre los animales y también en el hombre, originando infecciones que, debido a que se producen en un medio intracelular protegido, en su mayoría producen infecciones inaparentes y que se caracterizan por que las chlamydias pueden persistir y eliminarse durante mucho tiempo,lo que explica su elevada tasa de infecciosidad.1-4
En el hombre, la infección por C. trachomatis puede dar lugar a cuadros de uretritis, epididimitis, proctitis (inflamación de la mucosa rectal) y proctocolitis. En la mujer origina cervicitis, endometritis, proctitis y proctocolitis (inflamación de la mucosa de colon y recto). La infección crónica del tracto genital femenino puede originar la aparición de diferentes patologías: enfermedad inflamatoria pélvica, salpingitis, embarazo ectópico, peritonitis, síndrome de Fitz-Hugh-Curtis (perihepatitis) e infertilidad.1-5
OBJETIVO
En este artículo se pretende describir las características, la acción patógena y los métodos actualmente disponibles para la detección de Chlamydia trachomatis en el laboratorio de Microbiología, así como poner de manifiesto la importancia del diagnóstico de dicha infección para la rápida actuación e instauración de tratamiento para poder evitar las complicaciones asociadas a dichas infecciones.
METODOLOGÍA
Se lleva a cabo una revisión bibliográfica buscando información relevante en diversos artículos de revistas científico-sanitarias, empleando para ello buscadores en bases de datos como Elsevier y PubMed.
Como buscador de bibliografía y para consulta de términos y vocabulario científico- sanitario, se ha utilizado Google Scholar, páginas web relacionadas con el tema y documentación de organismos oficiales o de gran prestigio en el área de las Ciencias de la Salud y la Microbiología, como OMS (Organización Mundial de la Salud) y SEIMC (Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica).
También se ha seleccionado y extraído información de bibliografía relevante del área de Microbiología relacionada con el tema del presente artículo y disponible en la Biblioteca de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza.
RESULTADOS
Características de Chlamydia trachomatis:
Chlamydia trachomatis es un microorganismo procariota que hasta hace poco se consideraba más próximo a los virus,ya que es lo suficientemente pequeño como para atravesar filtros de 0,45 nm.1,2,3,4,5,6
Son parásitos intracelulares estrictos de células animales y humanas, ya que carecen de mecanismo biosintético autosuficiente para la síntesis de ATP y la producción de energía metabólica. Esto los limita a una existencia intracelular, donde la célula hospedadora elabora productos intermedios con abundante energía.1-6
En las últimas clasificaciones taxonómicas, se asocia a bacterias y concretamente próximas a Ricckettsias.5
Entre las características más importantes de Chlamydia trachomatis podemos señalar las siguientes:
– Son microorganismos de tamaño muy pequeño e inmóviles
– Poseen una membrana interna y otra externa semejantes a las de las bacterias gramnegativas, y se tiñen como cocos gramnegativos en la tinción de Gram.
– Poseen dos tipos de ácido nucleico: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) y se reproducen por división binaria.
– En su citoplasma presentan inclusiones de glucógeno características.
– Son sensibles a numerosos antibióticos antibacterianos.1-6
Una característica singular de Chlamydia trachomatis es su ciclo reproductivo complejo. En él participan dos formas diferenciadas del microorganismo: el corpúsculo elemental (adaptado a vivir fuera de la células) y el corpúsculo reticulado intracelular.1-6
El corpúsculo elemental (CE) tiene un tamaño de 0,2-0,4 µm y se observa al microscopio óptico como un coco muy pequeño, que se tiñe de rojo púrpura con la tinción de Giemsa y que por microscopía electrónica se observa con la típica imagen de «guisante arrugado» (forma esférica con una parte central más densa).4
El CE presenta una pared celular rudimentaria, semejante al de las bacterias gramnegativas, que comprende el 15 % del peso seco de la bacteria.Esta pared celular está constituida por una capa externa granulosa y una capa interna formada por macromoléculas de 18 nm, que adoptan una disposición regular de forma hexagonal. Contiene aminoácidos azufrados que forman de puentes disulfuro y que son los responsables de la rigidez y la escasa permeabilidad de la pared celular.4
EI CE es muy estable en el medio extracelular, muestra resistencia a diversos agentes (ondas sónicas,tripsina) y presenta propiedades tóxicas y, en algunas cepas también propiedades hemaglutinantes, pero metabólicamente es una forma inactiva incapaz de replicarse por división.4
Corpúsculo reticulado:
El corpúsculo reticulado(CR)es de mayor tamaño (0,6-1,2 µm) y de forma ovalada, y se tiñe de azul con la tinción de Giemsa.4
La pared celular del corpúsculo reticulado es más fina que la del corpúsculo elemental y representa el 5 % del peso seco de la bacteria. En el CR la capa interna ha desaparecido dividida en subunidades y contiene menos fosfolípidos, sin la presencia de metionina y cisteína ni formación de enlaces cruzados del peptidoglicano. En consecuencia, el CR es menos rígido y permeable para el ATP, nutrientes y productos finales del metabolismo.4
El CR una forma sensible y frágil, incapaz de sobrevivir en el medio externo y constituye la forma intracelular, metabólicamente activa y dotada de una gran capacidad de replicación.4
Ciclobiológico de Chlamydia trachomatis:
La forma infectiva de Chlamydia trachomatis es el corpúsculo elemental. La penetración en la célula representa una fase previa de contacto, que solo puede realizarse cuando existen compuestos o estructuras específicas. Se ha demostrado la existencia de compuestos termolábiles presentes en las chlamydias y de receptores sensibles a la tripsina en la membrana citoplasmática de las células susceptibles que facilitan la fijación. Algunas cepas de C. trachomatis, que presentan capacidad hemaglutinante,contienen una neuraminidasa que destruye el receptor en las células susceptibles.1,2,3,4,5
Una vez producida la fijación, el CE induce la penetración e infección de la célula, mediante un mecanismo semejante a la fagocitosis, que da lugar a la formación de una vesícula o fagosoma, a la vez que bloquea losmecanismos celulares de defensa, inhibiendo la fusión delfagosoma con los lisosomas de la célula infectada.1-5
A las pocas horas,el CE aumenta dos o tres veces de tamaño, la pared celular se hace más fina y permeable, permitiendo el paso de ATPy metabolitos, el nucleoide desaparece y el citoplasma se hace más esponjoso y homogéneo, dando lugar a la formación del corpúsculo reticulado. Esta forma intracelular, basófila y metabólicamente activa, se multiplica por división binaria. De esta manera, el número de CR aumenta y se agrupan formando el cuerpo de inclusión de estructura granular o cuerpo de inclusión de Halberstaedter yVon Prowazek.4
A continuación, los CR sufren un proceso de transformación por el cual se hacen de tamaño más pequeño, aparece el nucleoide, dando lugar a los corpúsculos intermedios, hasta que la pared celular se reorganiza y se forman de nuevo corpúsculos elementales.1-5
De esta manera llega un momento en que el cuerpo de inclusiónestá formado por partículasde diverso tamaño y diversas características tintoriales (corpúsculos elementales, reticulados e intermedios), los mayores de color azulado (CR) y los menores de violeta oscuro(CE).1-5
A medida que aumenta de tamaño, se hace mayor la proporción de CE y persisten los CR solo en la periferia. Por último, se produce la liberación de los CE que pueden infectar nuevas células.1-5
C. trachomatis tiene un metabolismo activo con una gran capacidad de síntesis. Sin embargo, es incapaz de generar compuestos productores de energía,por lo tanto,es un parásito obligado que depende de la célula del huésped para la obtención del ATP y de la energía necesaria para sus procesos de síntesis.1-4
Las características de los cuerpos de inclusión son de interés diagnóstico, ya que C. trachomatis forma cuerpos de inclusión únicos, densos y compactos, en forma de un casquete paranuclear, que se caracterizan por la acumulación de glucógeno, de manera que realizando una tinción con lugol toman un color castaño oscuro. Por el contrario, los cuerpos de inclusión de otras especies como Chlamydia psittaci, son más difusos y no acumulan glucógeno en cantidad apreciable.1-9
Acción patógena de Chlamydia trachomatis:
El tipo de células que puede infectar a Chlamydia trachomatis es limitado. Los receptores para los cuerpos elementales se restringen fundamentalmente a las células del epitelio cilíndrico no ciliado, cuboidal y de transición que se encuentran en las membranas mucosas de la uretra, el endocérvix, el endometrio, las trompas de Falopio, el ano y el recto, el aparato respiratorio y la conjuntiva.1-5
Las manifestaciones clínicas de las infecciones por C. trachomatis se producen a consecuencia de:
– Destrucción directa de las células durante la replicación.
– Respuesta inflamatoria del hospedador.1-4
Manifestaciones clínicas de las infecciones por Chlamydia trachomatis:
Las infecciones por Chlamydia trachomatis pueden dar lugar a diferentes manifestaciones clínicas. Las más importantes son: tracoma, linfogranuloma venéreo, uretritis y cervicitis o enfermedad inflamatoria pélvica en la mujer.1-9
Tracoma:
La infección produce un aumento de la respuesta inflamatoria que causa hinchazón y edema del párpado. Este es muchas veces el primer signo de la enfermedad. La enfermedad del tracoma puede dividirse en dos etapas:
– Fase aguda o tracoma activo: Es más frecuente en niños.Se caracteriza por una conjuntivitisdel párpado superior y una descarga mucoide omínimamente acuosa. Esta etapa inicial puede resolverse espontáneamente, aunque son frecuentes las sobre infecciones por Haemophilus influenzae,adenovirus o Molluscum contagiosum.7,8
– Fase crónica: Es más común en adultos jóvenes.Si no se instaura tratamiento en la fase aguda, la enfermedad evoluciona hacia la fase crónica,apareciendo cicatrices en la conjuntiva y abrasiones en la córnea. El daño crónico de la córnea genera pérdida de visión y ceguera en último término.7-9
Linfogranuloma venéreo (LGV):
El LGV es una enfermedad de transmisión sexual que produce una infección sistémica que implica invasión de los nodos linfoides, causando linfadenitis.4,6,7,8,9
En el linfogranuloma venéreo pueden diferenciarse tres fases:
– La primera etapa (3-30 días después de la práctica sexual de riesgo) se caracteriza por una lesión o lesiones ulcerativas o herpetiformes en la mucosa genital opiel adyacente. Esta lesión inicial puede ser también intrauretral, cervical o rectal causando uretritis,cervicitis y proctitis, respectivamente. Pero generalmente esta etapa suele ser asintomática o con muy pocos síntomas.
– La segunda etapa se produce 2-4 semanas después y se caracteriza por una linfadenopatía inguinal eritematosa y dolorosa(bubones), generalmente unilateral. Los habones pueden romperse espontáneamente, drenando pus. Durante esta etapa aparece fiebre, dolor de cabeza y dolor muscular.
– La tercera etapa implica complicaciones severas como el engrosamiento hipertrófico crónico con ulceración de los genitales externos que puede llegar a elefantiasis e infertilidad.4-9
Ante la sospecha de linfogranuloma venéreo, es muy importante tener en cuenta el diagnóstico diferencial con otras infecciones de transmisión sexualcomo herpes simplex, sífilis, pero también de linfomas y enfermedades inflamatorias intestinales,como la enfermedad de Crohn.7
Uretritis por Chlamydia trachomatis:
Chlamydia trachomatis es la causa del 20-55% de las uretritis no gonocócicas en el hombre, aunque la mitad de los infectados son asintomáticos. Es importante señalar que en el 20% de los casos existe coinfección simultánea con Neisseria gonorrhoeae.4,6-9
En estos casos, son frecuentes las descripciones de uretritis post gonocócicas que no son el resultado de una sobreinfección o postinfección, sino un enmascaramiento debido a que el período de incubación de N. gonorrhoeae es más corto (4 días para N. gonorrhoeae y 7-14 días para C. trachomatis) y por tanto la sintomatología de uretritis gonocócica aparecerá antes.7
En el hombre, la uretritis por C. trachomatis se caracteriza por un inflamación en el epidídimo, dolor testicular o escrotal generalmente unilateral. También se observa oligospermia, pero no se ha descrito que ocasione infertilidad.4,6-9
La uretritis también se puede producir en mujeres y se caracteriza por disuria, piuria y micción frecuente, que se puede confundir con una infección urinaria.4,6-8
Cervicitis y enfermedad inflamatoria pélvica:
La cervicitis mucopurulenta causada por Chlamydia trachomatis en mujeres es el equivalente a la uretritis no gonocócica del hombre.1,3,4,6,7
Aproximadamente el 50-70% de las mujeres con infección por C. trachomatis no presentan síntomas o la sintomatología es muy leve, pero las complicaciones son más serias que en el hombre,probablemente porque C. trachomatis puede persistir en estado asintomático por períodos prolongados en el tracto genital femenino.7
Esta cronificación puede facilitar la diseminación de C. trachomatis hacia el endometrio,causando endometritis, hacia las trompas de Falopio causando salpingitis o hacia el peritoneo causando peritonitis. Por difusión a través del peritoneo puede desarrollarse ascitis y perihepatitis (síndrome de FitzHugh-Curtis). Esas infecciones del tracto genital femenino se denominan,en conjunto, enfermedad inflamatoria pélvica (conocida como EIP o EPI) y se produce entre el 10-20% de los casos de cervicitis.1,3,4,6-9
Las consecuencias a largo plazo de la enfermedad inflamatoria pélvica son dolor pélvico crónico,embarazos ectópicos, partos prematuros e infertilidad.1,3,4,6-9
Las graves consecuencias de la enfermedad inflamatoria pélvica son la razón por la que se recomienda el cribado sistemático a mujeres en edad fértil.7,8
Diagnóstico de Chlamydia trachomatis en el laboratorio de Microbiología:
Hasta principios de los años 80, el cultivo celular ha sido el principal método para diagnosticar infecciones por Chlamydia trachomatis fue, pero ha sido reemplazado progresivamente por otras técnicas más sencillas,rápidas y que permiten un flujo de trabajo mayor.1,2,3,6,7,8,9
En la década de los 80, aparecieron los primeros ensayos de inmunofluorescencia usando anticuerpos monoclonales y las técnicas de enzimoinmunoensayo que por su sencillez llegaron a tener una gran aceptación. 6,7,8,9
Posteriormente, en los años 90 apareció la técnica de hibridación de ácidos nucleicos,pero el gran desarrollo del diagnóstico de la infección por C.trachomatis han sido las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos que permiten un flujo de trabajo elevado con excelente sensibilidad y especificidad,facilitando la instauración del cribado de la infección por C. trachomatis en población sexualmente activa.6,7,8,9
Toma de muestras para la detección de Chlamydia trachomatis:
Las muestras se deben obtener de la zona afectada (uretra, cérvix, recto, conjuntiva) y no es adecuada una muestra de pus o de exudado uretral, en donde puede haber un número relativamente escaso de microorganismos.6-9
Las chlamydias infectan las células del epitelio columnar o escamoso columnar y, por tanto, se deben recoger muestras endocervicales, pero no vaginales en el caso de sospecha de enfermedad inflamatoria pélvica en la mujer.6-9
Se estima que alrededor de un tercio de las muestras que se remiten al laboratorio, para su estudio en los pacientes con sospecha de infección por C. trachomatis,no son las apropiadas.6-9
Cultivo de C. trachomatis:
El cultivo celular de C. trachomatis ha sido el estándar de referencia frente al cual se han comparado todas las demás pruebas, pero debido a la aparición de nuevos métodos diagnósticos más fáciles de implementar, rápidos y sensibles, el cultivo celular ha quedado relegado a laboratorios de referencia, con utilidad en estudios epidemiológicos, forenses y de investigación.1,2,3,6-9
Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos:
Estas técnicas están basadas en la captura e hibridación de ácidos nucleicos mediante el empleo de sondas específicas.6-9
Se trata de una tecnología combinada, basada en la captación (o enriquecimiento) de las miles de copias del ARNr de C. trachomatis, seguida de una amplificación mediada por transcripción (TMA) y un ensayo de hibridación (HPA). 7,8,9
Sus ventajas son que se trata de un sistema totalmente automatizado, de fácil estandarización, con una carga de trabajo superior a otras plataformas, alta reproducibilidad por eliminación de los inhibidores en la fase de captación de la diana y elevada sensibilidad.7-9
Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos:
Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (conocidas como TAAN o Técnicas PCR) han supuesto el avance más importante para la detección de las infecciones por chlamydias desde el desarrollo del cultivo celular. Son las técnicas de última generación y dada su elevada sensibilidad y especificidad han desplazado al resto de técnicas convirtiéndose en el nuevo patrón de referencia para el diagnóstico de las infecciones por C. trachomatis.6-9
Las técnicas actualmente disponibles se basan en tecnología de PCR en tiempo real (qPCR). Estas técnicas están aprobadas para realizar la detección de C.trachomatis en muestras oculares, cervicales,uretrales, semen y muestras de orina.6-9
Algunas publicaciones han ensayado la utilidad de estas técnicas en otro tipo de muestras como faringe orecto, pero aún no han sido aprobadas por la FDA ni por la CE.7,8
Con el fin de aumentar la sensibilidad de la técnica,estos tests se basan en la detección de genes presentes en alto número de copias, como el plásmido críptico X06707 (∼10 copias/ genoma)presente tanto en los corpúsculos elementales como en los corpúsculos reticulados de C. trachomatis.7
Inmunoensayos para el diagnóstico de Chlamydia trachomatis:
Existen dos grupos de inmunoensayos:
– Técnicas basadas en la tinción directa de las muestras con anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína, conocidas como DFA.
–Técnicas inmunoenzimáticas o enzimoinmunoensayos, también llamadas EIA.6-9
Las plataformas que emplean DFA se basan en el uso de anticuerpos específicos marcados con fluoresceína dirigidos principalmente frente a antígenos de C. trachomatis. 6-9
Las principales ventajas de las DFAs son su rapidez(30 min) y especificidad cercana al 100%, la sensibilidad es del 85-90%, respecto al cultivo y no requiere un medio de transporte específico. 6,7,8,9
Entre sus desventajas está que la interpretación de losresultados es subjetiva y requiere personal experimentado, ofrecen baja reproducibilidad y el volumen demuestras no puede ser elevado.6,7,8,9
La tecnología EIA se basa en la detección del antígeno por la detección de una señal colorimétrica generada por la reacción del antígeno con el anticuerpo. 7,8
Se trata de técnicas muy sencillas de realizar, fácilmente interpretables, poco subjetivas y automatizadas por lo que han sido la técnica de elección en laboratorios con pocos recursos que no podían implementar las técnicas moleculares de PCR e hibridación de ácidos nucleicos, pero que tienen un elevado número de muestras. 6-9
La especificidad de las EIA es baja pudiendo darse falsos positivos por la presencia de otros LPS bacterianos, especialmente si la carga bacteriana es elevada. Por este motivo,las EIA no pueden emplearse en muestras rectales y faríngeas,ni tampoco en poblaciones de baja prevalencia. Además, no presentan una buena sensibilidad, por lo que cualquier resultado positivo deberá confirmarse por otra técnica, bienDFA o EIA usando otro antígeno.6-9
CONCLUSIONES
El ciclo biológico de Chlamydia trachomatis es bastante complejo y sólo puede infectar cierto tipo de células.
Al contrario de lo que ocurre con otras bacterias, Chlamydia trachomatis presenta un ciclo vital peculiar, ya que pasa por formas infecciosas inactivas desde el punto de vista metabólico (a las que se conoce como cuerpos elementales o CE) y por formas no infecciosas con actividad metabólica (llamadas cuerpos reticulados o CR).
El tracoma, el linfogranuloma venéreo, la uretritis y la cervicitis o enfermedad inflamatoria pélvica en la mujer son las manifestaciones clínicas producidas por las infecciones de Chlamydia trachomatis.
Las infecciones por C. trachomatis constituyen una de las causas más frecuentes de enfermedad de transmisión sexual en España, por lo que su diagnóstico es especialmente relevante, ya que causa no solo enfermedades inflamatorias del genitourinario, sino importantes secuelas como la infertilidad en mujeres, embarazo ectópico, dolor pélvico crónico y aumento de nacimientos prematuros.
El hecho de que las infecciones por C. trachomatis se presenten frecuentemente con síntomas leves o subagudos, dificulta y retrasa su diagnóstico contribuyendo a la potencial aparición de secuelas inflamatorias del tracto reproductor, por lo que destaca la importancia del cribado en personas asintomáticas sexualmente activas y en mujeres en edad fértil.
La infección por C. trachomatis se puede diagnosticar por cultivo,realizando pruebas basadas en ácidos nucleicos (técnicas de hibridación con sondas y técnicas de amplificación o PCR) y mediante inmunoensayos que detectan antígenos en muestras de pacientes infectados, ya sea usando plataformas DFA o enzimoinmunoensayos (EIA).
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