Optimización de la cuantificación del arn del virus de hepatitis delta mediante choque térmico y RT-PCR

AUTORES

1. Helena García López. Microbiología, Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza, España.
2. Carla Zumeta Martín. Microbiología, Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza, España.
3. Elena Alvarado Sánchez. Microbiología, Hospital de Alcañiz, Teruel, España.
4. Sara Arnal Leal. Microbiología, Hospital Ernest Lluch Martin, Catalayud, Zaragoza, España.
5. Assia Achkir el Azzouzi. Microbiología, Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza, España.
6. María Sarvisé Mata. Microbiología, Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza, España.

RESUMEN

El virus de la hepatitis D (VHD) es un virus ARN defectivo que requiere el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) para su ensamblaje y replicación, y representa la forma más grave de hepatitis viral. La infección puede producirse como coinfección aguda con el VHB o como superinfección en portadores crónicos de VHB, esta última asociada a un peor pronóstico. La detección precisa del ARN del VHD mediante RT-PCR es fundamental para confirmar la infección activa y evaluar la carga viral, ya que niveles elevados o persistentes se asocian con un mayor riesgo de progresión a cirrosis, descompensación hepática, carcinoma hepatocelular, necesidad de trasplante hepático y mortalidad.

Este estudio evaluó el impacto del choque térmico en la cuantificación del ARN del VHD mediante RT-PCR para mejorar la sensibilidad y la precisión diagnóstica. Se analizaron veinticuatro muestras de plasma o suero positivas para ARN del VHD. El ARN se extrajo utilizando MagLead®, y los eluatos se procesaron en paralelo con y sin choque térmico (10 min a 95 °C seguidos de 10 min a –20 °C). La cuantificación del ARN del VHD se realizó mediante el kit Hepatitis Delta Real Time PCR (Vircell, España) en un termociclador CFX Connect, comparándose los valores de ciclo umbral (Ct) y las cargas virales (UI/mL) entre ambas condiciones.

El choque térmico redujo significativamente los valores de Ct en una media de 2,29 unidades (p<0,05) e incrementó la detección de la carga viral en el 91,67 % de las muestras. Tres muestras inicialmente negativas se identificaron como positivas tras el tratamiento, mientras que dos muestras cercanas al límite de detección no mostraron mejoría. Estos resultados sugieren que la desestabilización de las estructuras secundarias del ARN mejora la eficiencia de la retrotranscripción y la amplificación, especialmente en muestras con cargas virales más elevadas.

PALABRAS CLAVE

Virus hepatitis delta, choque térmico, RT-PCR, carga viral.

ABSTRACT

Hepatitis D virus (HDV) is a defective RNA virus that requires the hepatitis B surface antigen (HBsAg) for assembly and replication, representing the most severe form of viral hepatitis. Infection may occur as acute coinfection with HBV or as superinfection in chronic HBV carriers, the latter associated with a worse prognosis. Accurate detection of HDV RNA by RT-PCR is critical for confirming active infection and assessing viral load, as elevated or persistent levels are linked to increased risk of cirrhosis progression, hepatic decompensation, hepatocellular carcinoma, liver transplantation, and mortality. This study evaluated the impact of thermal shock on HDV RNA quantification by RT-PCR to enhance diagnostic sensitivity and accuracy. Twenty-four HDV RNA-positive plasma or serum samples were analyzed. RNA was extracted using MagLead®, and eluates were processed in parallel with and without thermal shock (10 min at 95 °C followed by 10 min at –20 °C). HDV RNA quantification was performed using the Hepatitis Delta Real Time PCR kit (Vircell, Spain) on a CFX Connect thermocycler, comparing cycle threshold (Ct) values and viral loads (IU/mL) between conditions. Thermal shock significantly reduced Ct values by an average of 2.29 units (p<0.05) and increased viral load detection in 91.67 % of samples. Three samples initially negative were identified as positive after treatment, indicating preventable false negatives, while two samples near the detection limit showed no improvement. These findings suggest that destabilization of RNA secondary structure enhances reverse transcription efficiency and amplification, particularly in samples with higher viral loads. Pre-treatment with thermal shock significantly improves RT-PCR sensitivity and accuracy for HDV RNA detection and reduces false negatives, supporting its systematic implementation to optimize molecular diagnosis of HDV in clinical laboratories.

KEY WORDS

Hepatitis D virus, RT-PCR, heat-shock, viral load.

INTRODUCCIÓN

El virus de la hepatitis D (VHD) es un virus de ARN defectivo que requiere del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (VHB) (HBsAg) para su ensamblaje y replicación. La infección por este virus es la forma más grave de hepatitis viral pudiendo manifestarse como coinfección aguda con VHB o como sobreinfección en portadores crónicos de VHB (1,2), asociándose ésta última con un peor pronóstico (3).

La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima la prevalencia global de VHB en 296 millones de personas, y de estas, se estima que el 5%, más de 14 millones, están infectadas con VHD (4). Una estimación global en la población general, basada en un metaanálisis de 95 países miembros de la OMS, indicó una prevalencia de aproximadamente 0,16%, lo que equivale a 12 millones de personas. Otro metaanálisis estimó la prevalencia global en 0,80%, es decir, entre 48 y 60 millones de personas. Un tercer metaanálisis, mostró una prevalencia de 0,98%, o alrededor de 72 millones de personas. En personas positivas para HBsAg, la estimación de la prevalencia de VHD varía entre 4,5% y 14,6% (5-7).

En España, la prevalencia estimada es del 7,7% (8).

Las principales sociedades científicas recomiendan el cribado sistemático de VHD en todos los pacientes con HBsAg positivo (1,9). Estudios han demostrado la eficacia del diagnóstico en un solo paso con un aumento de más del doble en los diagnósticos de infección por VHD y un aumento significativo de la tasa de positividad de anti-VHD (del 6.8 % al 10.3 %), lo que permite una identificación más temprana de los pacientes infectados por VHB-VHD (10,11).

La confirmación de infección activa requiere la detección del ARN del VHD mediante técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, siendo la RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa) la herramienta más sensible para establecer el diagnóstico de infección replicativa y evaluar la respuesta al tratamiento (12). La carga viral de ARN-VHD tiene un valor clínico y pronóstico fundamental: niveles elevados o su detección persistente se asocia con mayor riesgo de progresión a cirrosis, descompensación hepática, carcinoma hepatocelular, trasplante hepático y mortalidad. (13,14)

Debido al fuerte emparejamiento interno de bases del genoma del VHD, utilizar el efecto del choque térmico para aumentar la ruptura de los puentes de hidrógeno y relajar la estructura interna del virus puede facilitar la etapa de transcripción inversa de la RT-PCR y optimizar el proceso de amplificación. (15)

OBJETIVO

Este estudio evalúa el impacto del choque térmico en la cuantificación del ARN-VHD mediante RT-PCR, con el fin de mejorar la sensibilidad y precisión del diagnóstico molecular.

METODOLOGÍA

Se analizaron 24 muestras positivas de plasma o suero de pacientes con carga viral detectable de VHD. La extracción de ARN de las muestras se realizó con MagLead® (volumen extracción: 200μl; volumen eluído: 50 μL). Los eluídos se procesaron de forma paralela: con y sin tratamiento de choque térmico (incubación de 10 minutos a 95°C, seguido de congelación inmediata a -20°C durante 10 minutos). Para la determinación del ARN-VHD se utilizó el equipo Hepatitis Delta Real Time PCR (Vircell, España) y como equipo se utilizó el termociclador CFX Connect Real Time PCR System. Se compararon los valores de Ct (umbral de ciclo) y las cargas virales (UI/mL) entre ambos grupos.

DISCUSIÓN

El kit de RT-PCR de Vircell está diseñado para la detección del ARN del virus de la hepatitis D (VHD) en suero y plasma humano, empleando como diana el gen que codifica el antígeno Delta e incluyendo todos los genotipos descritos (1–8). El protocolo del fabricante recomienda la aplicación de un choque térmico previo, con el fin de relajar la estructura secundaria del ARN y facilitar la transcripción inversa. No obstante, la evidencia experimental que respalde de manera sistemática la utilidad de este procedimiento ha sido escasa hasta la fecha.

Los resultados del presente estudio demuestran que la incorporación del choque térmico mejora significativamente la sensibilidad de la RT-PCR para el VHD. En particular, se observó una disminución promedio de 2,29 unidades en los valores de Ct (p<0,05), junto con un incremento en la carga viral detectada en el 91,67% de las muestras. Este hallazgo es consistente con lo descrito en otros virus ARN con estructuras secundarias complejas, como el virus de la hepatitis C y el VIH, en los que la desnaturalización térmica ha demostrado incrementar la eficiencia de la retrotranscripción y reducir la tasa de resultados indeterminados. El hecho de que en dos muestras no se observará dicho efecto, probablemente por encontrarse próximas al límite de detección. Tabla 1.

Un aspecto clínicamente relevante de este trabajo es la identificación de falsos negativos: tres muestras inicialmente clasificadas como negativas en ausencia de choque térmico resultaron positivas tras su aplicación. Considerando que la infección por VHD se caracteriza con frecuencia por cargas virales bajas y fluctuantes, la omisión de este procedimiento podría comprometer la capacidad diagnóstica, con implicaciones directas en la monitorización clínica y la toma de decisiones terapéuticas.

Este estudio aporta evidencia experimental que respalda la implementación del choque térmico como paso previo en la cuantificación del ARN-VHD, con un impacto directo en la sensibilidad diagnóstica y en la reducción de falsos negativos. No obstante, los resultados deben interpretarse con cautela: el tamaño muestral es limitado y no se evaluaron de forma específica las diferencias entre genotipos. Futuros estudios multicéntricos, que incluyan una representación más amplia de la diversidad genética del VHD, permitirán validar y generalizar estas observaciones.

En conjunto, nuestros hallazgos refuerzan la importancia de optimizar los protocolos de RT-PCR para el VHD y sugieren que la aplicación sistemática del choque térmico debería considerarse como una práctica estándar en el diagnóstico molecular de este virus.

CONCLUSIONES

El choque térmico mejora significativamente la detección y cuantificación del ARN-VHD mediante RT-PCR, optimizando la eficiencia de la transcripción inversa y aumentando así la sensibilidad diagnóstica. Este efecto se ve disminuido en muestras con cargas virales próximas al LT. Estos hallazgos representan una mejora relevante en la metodología diagnóstica del VHD y podrían mejorar significativamente el rendimiento diagnóstico del VHD en laboratorios clínicos.

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ANEXOS

ANEXO 1