La leishmaniasis

AUTORES

1. Aroa Calvo Sanjuan. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Facultad de Veterinaria de Zaragoza, Zaragoza. España.
2. Marta Fernández Marín. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Nuestra Señora de Gracia, Zaragoza. España.
3. Marta Iglesias Belles. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Nuestra Señora de Gracia, Zaragoza. España.
4. Olaia Grijalbo Barcenilla. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Facultad de Veterinaria de Zaragoza, Zaragoza. España.
5. Joan Marín Egea. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Facultad de Veterinaria de Zaragoza, Zaragoza. España.
6. Valvanera Uterga Rodríguez. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Clínica Veterinaria Albeitar, Zaragoza. España.

 

RESUMEN

La leishmaniosis es una enfermedad causada por Leishmania Spp. y es una de las enfermedades parasitarias más comunes tanto en humanos como en perros. Lo que se ha buscado con este trabajo ha sido exponer los mecanismos de acción de la enfermedad, para eso se ha explicado la morfología tanto del flebótomo como del parásito intracelular. Además, se ha definido el término de zoonosis para entender también su ciclo de vida y transmisión. La epidemiología es un punto importante para comprender el impacto que tiene sobre la población, al igual que las manifestaciones clínicas de la enfermedad. Se han detallado diversas técnicas de laboratorio para el diagnóstico de la leishmaniosis mediante técnicas serológicas, moleculares y cultivo. Dentro de las técnicas serológicas se han descrito los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas o ELISA, inmunofluorescencias e inmunocromatográficas y respecto a las técnicas moleculares, la PCR. Se ha reflejado que el tratamiento de la leishmaniosis sigue siendo un reto debido a que aún no se sabe con certeza cómo actúa el microorganismo y por tanto cómo eliminarlo, aun así se han usado diversos fármacos quimioterápicos.

PALABRAS CLAVE

Leishmaniasis, zoonosis, phlebotomus, reacción en cadena de la polimerasa, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunofluorescencia, inmunocromatografía, cultivo celular, quimioterapia.

ABSTRACT

The genus Leishmania is the protozoan responsible for the parasitic disease known as leishmaniosis, a frequent infection in both animals and humans. The current paper displays information about the morphology of the sandfly vector and the intracellular parasite so the disease’s mechanisms of action can be comprehended. To enhance understanding of the parasite’s life cycle and transmission routes, the concept of zoonosis is introduced. Furthermore, in the paper are mentioned its clinical manifestations and epidemiology, essential items to understand the impact on the human population. The diagnostic procedures are then detailed, including serological techniques such as ELISA, immunofluorescence, and immunochromatographic assays, alongside molecular methods like PCR and finally the culture. Despite the use of several chemotherapeutic agents, treatment remains difficult due to gaps in knowledge about the parasite’s biology, which hinder eradication efforts.

KEY WORDS

Leishmaniasis, zoonoses, phlebotomus, polymerase chain reaction, enzyme-linked immunosorbent assay, immunofluorescence, immunochromatography, cell culture, drug therapy.

DESARROLLO DEL TEMA

Morfología:

Los huevos tienen forma elíptica, con la cara dorsal convexa y la ventral ligeramente cóncava, alcanzando entre 0,3 y 0,5 mm de largo por aproximadamente 0,1 mm de ancho. En el momento de la puesta presentan un color blanquecino-amarillento pálido, que se oscurece a las pocas horas. Su cubierta externa presenta ornamentaciones características en forma hexagonal, cuyo patrón puede variar según la especie.

Los cuatro estadios larvarios se asemejan a pequeñas orugas y miden, al eclosionar, entre 0,5 y 1 mm. En el abdomen presentan como órganos locomotores unos pseudópodos o falsas patas. Su característica más destacada es la presencia de largas sedas en la región posterior o caudal: un par en las larvas del primer estadio y dos pares en los tres estadios larvarios siguientes¹.

Las pupas de los flebótomos miden aproximadamente 3 mm de largo. Son blanquecinas al principio y se oscurecen progresivamente hasta volverse casi negras. Poco antes de que emerja el adulto, este se vuelve visible por transparencia. Una de las estructuras más fácilmente reconocibles es la exuvia, o cubierta del último estadio larvario, adherida a la región posterior, la cual conserva los pares de sedas característicos de las larvas maduras.

Los adultos, de tamaño muy pequeño (entre 1 y 4 milímetros de longitud), se caracterizan por presentar patas finas y largas, siendo el tercer par más largo que los otros dos, y un par de alas lanceoladas. Tanto el cuerpo como las alas están recubiertos por abundantes sedas de color gris amarillento, lo que les otorga un aspecto velloso. Los machos y las hembras se distinguen por la forma del abdomen: roma en las hembras, mientras que los machos presentan una genitalia compleja, que les da un aspecto en forma de gancho².

Este parásito presenta una forma ovalada o esférica, con un tamaño aproximado de entre 1,5–2,5 × 3–6 micras. Como muchos parásitos, posee un ciclo de vida digenético, lo que significa que presenta dos formas: una intracelular y otra extracelular. Cabe destacar que la estructura celular básica se conserva en ambas.

La forma celular está determinada por microtúbulos que se mantienen durante todo el ciclo celular, por lo que la división celular depende de la elongación de estos microtúbulos.

En el interior de la célula se encuentran el núcleo y diversos orgánulos de una sola copia, como el aparato de Golgi y la mitocondria. Rodeando las estructuras internas se encuentra el cinetoplasto, una masa de ADN mitocondrial concatenado que se extiende desde la base del flagelo hasta la «cabeza» del parásito. En la base del flagelo se localiza una invaginación de la membrana celular denominada «bolsillo flagelar», una estructura de gran relevancia funcional, ya que constituye el único sitio donde se llevan a cabo los procesos de endocitosis y exocitosis³.

Ciclo de vida y transmisión:

El parásito está expuesto a entornos extracelulares cuando se encuentra en el flebótomo, y a entornos intracelulares cuando reside en el hospedador vertebrado. El ciclo de vida de Leishmania comienza con la picadura de una mosca de la arena hembra infectada que transmite el parásito al picar a un animal o a un ser humano; en este caso, el insecto actúa como vector.

Los promastigotes metacíclicos inoculados son fagocitados por los macrófagos de la piel, quienes los dirigen hacia el compartimento fagolisosomal. Allí, los promastigotes se transforman en amastigotes intracelulares obligados (es decir, que no pueden reproducirse fuera de una célula huésped) al perder el flagelo.

Tras replicarse dentro de la vacuola parasitófora, algunos macrófagos infectados se destruyen, liberando a los amastigotes que pueden invadir nuevas células. Cuando un flebótomo se alimenta de un animal o humano infectado, ingiere los amastigotes, que en el intestino medio del insecto recuperan el flagelo y vuelven a diferenciarse en promastigotes, repitiéndose así el ciclo⁴.

Leishmania como zoonosis:

Según la Directiva 2003/99/CE, las zoonosis se definen como «cualquier enfermedad o infección transmisible de manera natural entre los animales y las personas, de forma directa o indirecta».

En los últimos años, se ha observado un aumento en los casos de zoonosis de ciertas enfermedades, como consecuencia del constante tráfico internacional de personas y mercancías, favorecido por la globalización⁵.

Se conocen al menos 21 especies de Leishmania que afectan al ser humano. En España, la mayoría de los casos son causados por Leishmania infantum, cuya transmisión se produce principalmente a través de un ciclo que involucra a perros domésticos, conejos, liebres y ratas. Los vectores más relevantes en la península ibérica son Phlebotomus perniciosus y Phlebotomus ariasi⁶.

De las aproximadamente 500 especies de flebótomos identificadas, solo unas 30 son capaces de transmitir leishmaniosis. Estas especies tienden a aparecer durante las estaciones cálidas, coincidiendo con el inicio de la actividad de los flebótomos adultos. El riesgo de contagio por contacto directo con personas infectadas o por manipulación de muestras clínicas es muy bajo, ya que la transmisión ocurre exclusivamente a través de la picadura del vector y no existen formas de resistencia del parásito en el medio ambiente⁷.

Epidemiología:

A pesar de haber sido una enfermedad históricamente desatendida, la leishmaniosis ha provocado problemas de salud pública en más de 90 países. Según un estudio conjunto de la Organización Mundial de la Salud, la Organización Mundial de Sanidad Animal y los Ministerios de Sanidad, ilustrado por Redacción (2023), en 22 países europeos se notificaron 8.367 casos en humanos, de los cuales el 69 % correspondían a leishmaniosis visceral y el 31 % a la forma cutánea.

Manifestaciones clínicas y tipos de leishmaniasis:

La sintomatología de la leishmaniosis puede incluir: pérdida de peso, fiebre, linfadenopatía, úlceras orales, pápulas, dermatitis nodular, onicogrifosis, epistaxis, diarrea, esplenomegalia, enfermedad renal con nefritis, glomerulonefritis, hematuria y uremia, lesiones osteolíticas, vasculitis autoinmune, trastornos neurológicos y lesiones oculares como queratoconjuntivitis, blefaritis y uveítis.

Los pacientes con leishmaniasis cutánea comienzan a mostrar síntomas aproximadamente dos semanas después del periodo de incubación. Inicialmente, aparecen pápulas en las zonas donde el mosquito ha picado, las cuales tienden a transformarse en úlceras. Estas lesiones pueden ser únicas o múltiples y, en general, cicatrizan espontáneamente, dejando una marca. No obstante, en algunos casos pueden diseminarse o volverse crónicas. Este último fenómeno podría estar relacionado con una mayor actividad de la enzima arginasa en los leucocitos polimorfonucleares, entre otros factores⁸.

La leishmaniasis mucocutánea puede manifestarse de manera simultánea con la forma cutánea o bien aparecer posteriormente, una vez que las lesiones iniciales han desaparecido. Las zonas más afectadas suelen ser las mucosas orales y nasales, aunque la infección puede extenderse hacia la laringe y la orofaringe. En fases avanzadas, pueden presentarse lesiones más severas, como la perforación del tabique nasal. En su forma más grave, esta variante de la enfermedad puede desencadenar la destrucción de la mucosa oronasofaríngea, provocando obstrucción de las vías respiratorias, desfiguración e infecciones secundarias⁹.

La leishmaniasis visceral, también conocida como kala-azar —término que en hindi significa «enfermedad negra»—, es la forma más letal de las tres. Se trata de una infección sistémica que, en ausencia de tratamiento, con frecuencia resulta mortal. Aunque su presentación clínica puede variar, los síntomas más comunes incluyen fiebre, hepatoesplenomegalia o esplenomegalia, citopenia, anemia y neutropenia, que deben tratarse con urgencia para evitar el desarrollo de sepsis. La progresión de la enfermedad depende en gran medida del mantenimiento de un estado inmunosupresor inducido por el propio parásito, incluyendo la manipulación de los macrófagos de la célula huésped¹⁰.

Pruebas de laboratorio para el diagnóstico:

Tinción panóptico rápido:

En primer lugar, para realizar un diagnóstico de leishmaniasis, se lleva a cabo una visualización directa al microscopio de un frotis de médula ósea, el cual se tiñe mediante un panóptico rápido para así poder observar si hay o no amastigotes inoculados dentro de los macrófagos⁷.

Esta técnica es una variación de la tinción de Romanowsky y se utiliza para visualizar células sanguíneas al microscopio. En este caso se utilizan dos colorantes, la hematoxilina y la eosina, la hematoxilina es el colorante básico, es decir, tiñe la estructura del núcleo con un color azulado, y la eosina es el colorante ácido que se encarga de teñir el citoplasma de un color rosado, así con la ayuda de los dos reactivos se obtiene un resultado contrastado para así poder diferenciar los distintos tipos de células. Antes de introducir la muestra en la hematoxilina o en la eosina, se sumerge en un fijador para asegurar una tinción y preservación correcta de las células. Normalmente se compran kits con los reactivos ya preparados¹¹.

El procedimiento es muy rápido, consiste en realizar un frotis sobre un portaobjetos con la muestra obtenida de la médula ósea, cuando la extensión esté completamente seca, se realizan cinco pases de 1 segundo en el fijador y se vierte el líquido restante, después se realizan cinco pases de 1 segundo en la eosina y se vierte el líquido restante y finalmente se realizan cinco pases de 1 segundo en la hematoxilina, se lava el portaobjetos cuidadosamente con agua destilada y se deja secar, una vez seco estará listo para colocarlo bajo el microscopio¹².

ELISA:

El ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) es una técnica de inmunodiagnóstico que permite la detección y cuantificación específica de anticuerpos o antígenos presentes en una muestra. Se trata de un enzimoinmunoensayo heterogéneo, que puede ser competitivo o no competitivo.

Cuando se dispone de un antígeno específico para una sustancia determinada, este puede utilizarse para identificar el anticuerpo correspondiente. En el ELISA se emplean microplacas de polipropileno a las que se adhieren los antígenos, los cuales se unirán a los anticuerpos específicos si están presentes en la muestra. Para evitar uniones inespecíficas con otras sustancias, se realizan lavados que eliminan los componentes no deseados. Por este motivo, las microplacas deben tener la capacidad de absorber antígenos y anticuerpos, pero no el resto de los reactivos utilizados durante el procedimiento. La reacción antígeno-anticuerpo se detecta mediante un conjugado unido a una enzima y un sustrato enzimático, que produce un cambio de color. Entre las enzimas más utilizadas se encuentran la beta-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina¹³.

Para el diagnóstico de Leishmania se emplea comúnmente un ELISA indirecto, que consiste en inmovilizar el antígeno de interés sobre una superficie sólida. A continuación, se añade un anticuerpo primario específico que se une al antígeno. Posteriormente, se incorpora un anticuerpo secundario específico para el anticuerpo primario, y no para el antígeno. Finalmente, se añade un sustrato que reacciona con la enzima conjugada al anticuerpo secundario, generando un cambio de color cuya intensidad es proporcional a la concentración del antígeno presente¹⁴.

La muestra utilizada suele ser suero o sangre del paciente, que se alícuota en eppendorfs de 1,5 mL. Si no se va a utilizar de inmediato, la muestra debe almacenarse a -20 ºC hasta su procesamiento. La sangre puede recogerse mediante punción con aguja y depositarse sobre papel absorbente; una vez seca, la muestra se eluye para su análisis⁷.

Inmunofluorescencia:

El método de inmunofluorescencia es un tipo de fluoroinmunoensayo que permite la visualización de un antígeno o anticuerpo diana mediante el uso de fluorocromos, compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por una fuente de luz de una longitud de onda específica¹⁵.

En este caso se emplea la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Primero, se aplica un anticuerpo primario no marcado que se une específicamente al antígeno de interés. Posteriormente, se añade un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo o fluorocromo, el cual se une al anticuerpo primario, permitiendo así la detección mediante microscopía de fluorescencia¹⁶.

Inmunocromatografía:

Los tests de inmunocromatografía, comúnmente conocidos como tests rápidos, son técnicas de diagnóstico que se basan en el desplazamiento de la muestra a lo largo de una membrana de nitrocelulosa. Estas pruebas permiten un diagnóstico preliminar de forma rápida y sencilla. Sin embargo, en caso de obtener un resultado positivo, es recomendable confirmar el hallazgo mediante una prueba serológica más específica¹⁷.

El test emplea oro coloidal conjugado con antígenos virales. Si en la muestra están presentes anticuerpos específicos, estos se unirán a los antígenos conjugados. Al aplicar la muestra y añadir el tampón (buffer), esta se desplaza por capilaridad a lo largo de la tira reactiva. Si el resultado es positivo, los anticuerpos se unirán a los conjugados, generando complejos antígeno-anticuerpo que se acumulan en las zonas de lectura (línea de test y línea de control), formando bandas coloreadas visibles¹⁸.

La lectura de resultados es visual y se basa en la aparición de estas líneas coloreadas: si únicamente se marca la línea de control, el resultado es negativo; si aparecen tanto la línea de control como la línea de test, el resultado es positivo; y si solo se marca la línea de test pero no la de control, el resultado se considera inválido¹⁵.

Cultivo:

El cultivo de microorganismos es una técnica in vitro que consiste en preparar un medio con las condiciones necesarias para mantener vivas las células deseadas, preservando sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas al máximo. Existen diversos tipos de cultivos: de órganos, de explantes primarios, cultivo celular primario y cultivos histotípicos y organotípicos. En este contexto, se emplea el cultivo celular primario, el cual puede realizarse en monocapa (creciendo sobre un soporte sólido) o en suspensión (donde las células se desarrollan libres en el medio de cultivo).

A partir de estos cultivos pueden generarse subcultivos, que consisten en células derivadas del cultivo inicial, disgregadas mediante métodos enzimáticos y trasladadas a nuevas placas o frascos con medio fresco. En el caso de células en suspensión, el subcultivo se realiza simplemente diluyendo la población celular con nuevo medio¹⁹.

Para la detección de Leishmania, el cultivo es útil para observar el desarrollo de promastigotes viables, una característica distintiva del género. Las muestras adecuadas para este procedimiento incluyen aspirados de ganglio linfático, médula ósea, raspados cutáneos o biopsias. En casos de leishmaniasis visceral (LV), también puede emplearse sangre.

Dado que aún no existe un medio universal para el cultivo de Leishmania, se recomienda utilizar agar-sangre, preferiblemente con medio NNN (Novy, McNeal y Nicolle). En ausencia de éste, puede utilizarse medio sólido de infusión de cerebro y corazón (BHI) o EMTM como alternativa⁷. El medio de cultivo ideal debería mantener las condiciones en las que se encuentran los promastigotes en el vector.

Si se realiza el cultivo en medio NNN con unas gotas de medio Schneider, en aproximadamente 6-7 días se alcanza la fase estacionaria. La placa debe ser incubada entre 20ºC y 25ºC dado que el parásito tiende a crear lesiones en las zonas más frías del cuerpo. Para alcanzar el periodo de viabilidad se realizan resiembras cada 7 días, si se realiza en un medio de cultivo líquido solo se realizan cada 3 o 5 días en función de la especie, además, se recomienda mantener los cultivos al menos tres meses ya que se ha demostrado que algunas cepas pueden tardar más tiempo en crecer²⁰.

PCR:

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, es una técnica molecular de diagnóstico o de identificación en diferentes tipos de muestras. Con esta prueba se obtienen copias de una secuencia específica de ADN o de ARN, también se utiliza para modificar y amplificar genes para estudiar su expresión. Las PCRs más utilizadas para detectar Leishmania son la PCR en tiempo real, la tradicional y la anidada⁷.

El procedimiento consta de tres pasos principales que se repiten continuamente dentro de un termociclador: Desnaturalización, hibridación y elongación. Para llevarlos a cabo se utilizan los primers o cebadores, el ADN molde, la polimerasa de ADN termoestable y los nucleótidos.

Los cebadores son los oligonucleótidos complementarios al final de la secuencia diana, éstos son diseñados a medida para cada muestra. En el ADN molde se encuentra la secuencia diana que queremos amplificar. Para la amplificación del ADN, la polimerasa crea copias de la secuencia de ADN con la ayuda de los oligonucleótidos que realizan la función de los primers, este ciclo se repite hasta que ya no queden cebadores o que el ADN bicatenario o los nucleótidos libres alcancen una concentración que inhibe la reacción.

La desnaturalización se da cuando la muestra alcanza los 94ºC, lo que provoca que la cadena bicatenaria de ADN se quiebre y queden dos cadenas monocatenarias separadas. Después, la temperatura baja y permanece entre los 45ºC y los 60ºC para así permitir que los cebadores se hibriden al ADN molde, formando dos cadenas bicatenarias a las que se adhiere la polimerasa para poder seguir replicando el ADN molde, la extensión, este paso se realiza a 72ºC²¹.

La PCR a tiempo real permite cuantificar la muestra al mismo tiempo que se está procesando en el termociclador. Mientras se está amplificando, los amplicones son cuantificados con un sistema de ‘’tubo cerrado’’ o con sistemas de detección de fluorescencia, por lo que se obtiene un resultado por cada ciclo realizado. En este caso se utiliza un termociclador óptico para poder supervisar las moléculas fluorescentes que son excitadas asociadas a la producción de amplicones²².

En la PCR anidada se utilizan dos reacciones de amplificación secuenciales en las que se agregan pares de cebadores distintos. Esto se realiza ya que la segunda PCR utiliza como ADN molde el resultado de amplificación de la primera. Esta técnica se utiliza cuando se requiere una sensibilidad y especificidad aún mayor, se da un aumento de la sensibilidad por el uso de dos pares de oligonucleótidos, ya que así se pueden realizar más ciclos y el aumento de especificidad se da por la unión de dos pares de cebadores distintos que se unen a la misma secuencia diana²³.

Los kinetoplástidos flagelados poseen el ADN kinetoplasto (kDNA), un genoma mitocondrial compuesto por múltiples moléculas de ADN circular, su estructura se compone de un maxicircle y un minicircle. Se ha demostrado que los primers desarrollados con minicircles son más utilizados que otros²⁴.

Para la interpretación del resultado de la PCR se realiza una electroforesis, una técnica empleada para identificar, purificar y separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se utilizan geles de agarosa o de poliacrilamida, las muestras son colocadas junto con el buffer y un colorante en las ranuras del gel cuidadosamente para no quebrarlo, se deposita en un recipiente lleno de TBE y se activa una corriente eléctrica de tal forma que las moléculas migran del lado con carga negativa al lado con carga positiva. Conforme corre la muestra por el gel, las moléculas más pequeñas viajan más rápido, por lo que se detienen más cerca del polo positivo, mientras que las moléculas de mayor tamaño se desplazan más despacio y quedan depositadas más cerca del polo negativo.

Para la lectura de la electroforesis se coloca el gel bajo luz ultravioleta, la cual permite observar las bandas iluminadas. Los resultados obtenidos se comparan con el marcador que previamente ha sido introducido en el gel, y con los controles positivos y negativos, que se sitúan generalmente en los últimos carriles para poder contrastar correctamente todas las muestras²⁵.

Tratamiento y prevención:

El tratamiento de la leishmaniosis presenta múltiples desafíos, principalmente debido a la toxicidad de los fármacos disponibles, sus efectos secundarios y la creciente aparición de cepas resistentes, lo que pone de manifiesto la necesidad urgente de nuevas estrategias terapéuticas.

En general, cuando un paciente con leishmaniosis cutánea no presenta lesiones graves ni riesgo de diseminación hacia las mucosas, se opta por una vigilancia clínica sin instaurar tratamiento. Sin embargo, si existen signos de metástasis o afectación sistémica, debe iniciarse tratamiento antileishmaniasico de forma inmediata.

Para el tratamiento de la leishmaniasis cutánea se emplean fármacos por vía parenteral como el desoxicolato de anfotericina B y los antimoniales pentavalentes, entre ellos el antimoniato de meglumina y el estibogluconato de sodio. También se utilizan formulaciones liposomales de anfotericina B y el isetionato de pentamidina. Por vía oral, se recetan antifúngicos del grupo de los azoles. Para tratamiento local, se aplican preparados tópicos de paromomicina, así como terapias físicas como la termoterapia o la crioterapia con nitrógeno líquido. En los casos de leishmaniasis mucocutánea y visceral se recurre a los mismos agentes empleados por vía parenteral. En todos los casos, el tratamiento debe adaptarse individualmente a cada paciente²⁶.

Actualmente no existe una profilaxis específica para ningún tipo de leishmaniasis. Por tanto, la única estrategia eficaz para reducir la incidencia de la enfermedad en humanos y animales consiste en el control de la población de flebótomos, vectores responsables de la transmisión.

Se debe gestionar el medio de tal forma que se evite la reproducción del insecto, como por ejemplo realizando saneamientos frecuentes en el subsuelo urbano, o modificaciones en el hábitat como sellar cavidades que conecten con el alcantarillado. Para facilitar esto, también se recomienda ofrecer información sobre las consecuencias que puede traer no mantener un control adecuado de los vectores a la población para que así se tomen medidas personalizadas como por ejemplo poner mosquiteras en las ventanas y así imposibilitar la entrada de los mosquitos. Y finalmente se puede tomar acción contra los insectos de forma directa con insecticidas de síntesis química, pero esta medida debe ser estudiada ya que todavía no existen productos que permitan la interrupción rápida de su ciclo biológico, los tóxicos más frecuentes son los organoclorados, organofosforados y piretroides⁶.

CONCLUSIONES

La leishmaniasis, debido a su carácter zoonótico, así como por su amplia distribución geográfica, supone un problema de vital importancia en el sector sanitario. A fin de facilitar el diagnóstico de la misma, la investigación ha brindado técnicas de laboratorio serológicas y moleculares, además de importante información acerca de la biología del parásito, su ciclo vital, las distintas formas clínicas de la enfermedad, los vectores implicados y los desafíos que presenta su tratamiento y control.

Esta enfermedad continúa siendo de gran importancia, tanto en humanos como en animales, debido a su complejidad diagnóstica y a la variedad de formas clínicas que puede presentar. En este contexto, el papel del laboratorio resulta esencial, ya que permite confirmar la presencia del parásito y orientar el tratamiento de forma adecuada.

En primer lugar, las técnicas de visualización directa, como el frotis teñido con panóptico rápido o la tinción Giemsa, son pruebas importantes en el diagnóstico inicial. Se utiliza cuando existen muestras con gran carga parasitaria, como aspirados de médula ósea o de lesiones cutáneas activas. Aunque se trata de procedimientos rápidos y de bajo coste económico, su sensibilidad es baja, especialmente en formas crónicas o en pacientes con carga parasitaria reducida. Requieren, además, una buena preparación del material y una interpretación correcta.

El cultivo en medio NNN, combinado con medio Schneider u otras variantes enriquecidas, ha demostrado ser eficaz para cultivar cepas viables de Leishmania. A pesar de su utilidad, el cultivo presenta algunos inconvenientes, como el tiempo prolongado de incubación de varios días o incluso semanas, la necesidad de condiciones de temperatura controladas y la susceptibilidad a contaminación. Además, no siempre es posible conseguir que los parásitos del cultivo crezcan adecuadamente, por lo que suele considerarse una técnica complementaria y no excluyente.

Por otro lado, las técnicas serológicas, como el ELISA y la inmunofluorescencia indirecta, permiten detectar la presencia de anticuerpos específicos contra Leishmania en muestras de suero. Estas pruebas son útiles en el cribado y seguimiento de pacientes, así como en estudios epidemiológicos. El ELISA es una técnica de alta sensibilidad y aplicable para todos los casos posibles. Sin embargo, presenta ciertas limitaciones, los resultados pueden verse afectados por infecciones pasadas o cruzadas, y en algunos pacientes inmunosuprimidos los niveles de anticuerpos pueden no reflejar el verdadero estado del enfermo.

La inmunofluorescencia indirecta, aunque es más específica que el ELISA, requiere condiciones más estrictas de procesamiento y una correcta interpretación mediante microscopía de fluorescencia. Esta técnica puede ser especialmente útil en casos de sospecha con serologías negativas o dudosas, ya que ofrece mayor sensibilidad en ciertos estadios de la enfermedad.

En los últimos años, la técnica de PCR ha supuesto un gran avance en el diagnóstico de la leishmaniasis. Tanto en su forma convencional como en las variantes en tiempo real o anidada, permite detectar directamente el ADN del parásito en múltiples tipos de muestra. Esta técnica destaca por su alta sensibilidad, lo que la hace especialmente útil en casos en los que otras técnicas no logran detectar el patógeno. También permite identificar variantes específicas de Leishmania, lo cual ayuda a individualizar el tratamiento y seguimiento del paciente. No obstante, su aplicación requiere equipamiento especializado y condiciones estériles estrictas para evitar contaminación.

La PCR en tiempo real ofrece, además de una mayor precisión, la posibilidad de cuantificar la carga parasitaria, que resulta de gran utilidad en el seguimiento de la evolución de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. Por su parte, la PCR anidada, al emplear dos pares de cebadores y realizar una doble amplificación, mejora la especificidad y permite obtener resultados positivos incluso en muestras con cantidades reducidas de material genético.

Otra técnica complementaria descrita en este proyecto es el proteinograma, que permite valorar alteraciones en las proteínas séricas asociadas a la leishmaniasis, como la hipergammaglobulinemia o la hipoalbuminemia. Aunque no es un método diagnóstico directo del parásito, aporta información útil sobre el estado general del paciente, especialmente en fases avanzadas o en presencia de compromiso multiorgánico.

Por último, los tests rápidos de inmunocromatografía son la opción más práctica para situaciones en las que se necesita una respuesta inmediata o donde no se dispone de laboratorio equipado. Pese a no tener ni la sensibilidad ni la especificidad que, si tienen otras técnicas serológicas como el ELISA o la IFI, brindan un diagnóstico válido para comenzar, que es necesario confirmar empleando pruebas más completas.

En conclusión, el diagnóstico de la leishmaniasis se respalda en una combinación de métodos que permitan aumentar la precisión diagnóstica y adaptarse a las características del paciente, la forma clínica y los recursos disponibles. La elección de una u otra técnica depende del tipo de muestra, la fase de la enfermedad, la carga parasitaria, y los recursos de los que disponga el laboratorio encargado de analizar la muestra.

BIBLIOGRAFÍA

1. Gállego Berenguer J, Botet J, Portús Vynieta M, Gállego M. Los flebotomos de la España peninsular e Islas Baleares: identificación y corología: comentarios sobre los métodos de captura. En: In memoriam al profesor doctor D Francisco de Paula Martínez Gómez. Servicio de Publicaciones; 1992. p. 579–600.
2. Entomología Ambiental y Aplicada [Internet]. Bioucm.es. [citado el 15 de agosto de 2025]. Disponible en: https://web.bioucm.es/cont/eaa/sesiones.php?bloque=3&sesion=103&utm_s
3. Sunter J, Gull K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biol [Internet]. 2017;7(9). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1098/rsob.170165
4. Ilg T, Handman E, Stierhof YD. Proteophosphoglycans from Leishmania promastigotes and amastigotes. Biochem Soc Trans [Internet]. 1999;27(4):518–25. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1042/bst0270518
5. Zoonosis [Internet]. Gob.es. [citado el 15 de agosto de 2025]. Disponible en: https://www.mapa.gob.es/es/ganaderia/temas/sanidad-animal-higiene-ganadera/sanidad-animal/zoonosis-resistencias-antimicrobianas/zoonosis.aspx
6. MESA II. Zoonosis. Leishmaniasis. One Healh [Internet]. Enfermedadesemergentes.com. [citado el 15 de agosto de 2025]. Disponible en: https://enfermedadesemergentes.com/articulos/a822/dia25_mesa2.pdf
7. Woah.org. [citado el 15 de agosto de 2025]. Disponible en: https://www.woah.org/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/3.01.11_Leishmaniosis.pdf
8. Abadías-Granado I, Diago A, Cerro PA, Palma-Ruiz AM, Gilaberte Y. Leishmaniasis cutánea y mucocutánea. Actas Dermosifiliogr [Internet]. 2021;112(7):601–18. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.ad.2021.02.008
9. David CV, Craft N. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Dermatol Ther [Internet]. 2009;22(6):491–502. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1111/j.1529-8019.2009.01272.x
10. Kaye PM, Cruz I, Picado A, Van Bocxlaer K, Croft SL. Leishmaniasis immunopathology-impact on design and use of vaccines, diagnostics and drugs. Semin Immunopathol [Internet]. 2020;42(3):247–64. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1007/s00281-020-00788-y
11. Horobin RW. How Romanowsky stains work and why they remain valuable – including a proposed universal Romanowsky staining mechanism and a rational troubleshooting scheme. Biotech Histochem [Internet]. 2011;86(1):36–51. Disponible en: http://dx.doi.org/10.3109/10520295.2010.515491
12. Casaalvarez.com. [citado el 15 de agosto de 2025]. Disponible en: https://casaalvarez.com/catalogos/PANOPTICO%20RAPIDO_PP.pdf
13. Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides [Internet]. 2015;72:4–15. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012
14. Milchram L, Soldo R, Regele V, Schönthaler S, Degeorgi M, Baumgartner S, et al. A novel click chemistry-based peptide ELISA protocol: development and technical evaluation. Biotechniques [Internet]. 2022;72(4):134–42. Disponible en: http://dx.doi.org/10.2144/btn-2021-0107
15. Donaldson JG. Immunofluorescence staining. Curr Protoc Cell Biol [Internet]. 2015;69(1):4.3.1-4.3.7. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1002/0471143030.cb0403s69
16. Fritschy J-M, Härtig W. Indirect immunofluorescence of cultured cells. En: Encyclopedia of Life Sciences. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd; 2001.
17. Veterinario D. Un estudio destaca la incidencia de leishmaniasis humana en la mayoría de regiones de España [Internet]. Diario Veterinario. 2023 [citado el 15 de agosto de 2025]. Disponible en: https://www.diarioveterinario.com/t/4394828/estudio-destaca-incidencia-leishmaniasis-humana-mayoria-regiones-espana
18. He X, Hao T, Geng H, Li S, Ran C, Huo M, et al. Sensitization strategies of lateral flow immunochromatography for gold modified nanomaterials in biosensor development. Int J Nanomedicine [Internet]. 2023;18:7847–63. Disponible en: http://dx.doi.org/10.2147/IJN.S436379
19. INTRODUCCIÓN AL CULTIVO CELULAR [Internet]. Ehu.eus. [citado el 15 de agosto de 2025]. Disponible en: https://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/cultivo_celular.pdf
20. Montealegre Santa IA. Importancia de los medios de cultivo en el diagnóstico de leishmaniasis. Nova [Internet]. 2010;8(14). Disponible en: http://dx.doi.org/10.22490/24629448.444
21. Canene-Adams K. General PCR. Methods Enzymol [Internet]. 2013;529:291–8. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-418687-3.00024-0
22. Singh C, Roy-Chowdhuri S. Quantitative real-time PCR: Recent advances. Methods Mol Biol [Internet]. 2016;1392:161–76. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4939-3360-0_15
23. Green MR, Sambrook J. Nested polymerase chain reaction (PCR). Cold Spring Harb Protoc [Internet]. 2019;2019(2):db.prot095182. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1101/pdb.prot095182
24. Conter CC, Mota CA, Dos Santos BA, de Souza Braga L, de Souza Terron M, Navasconi TR, et al. PCR primers designed for new world Leishmania: A systematic review. Exp Parasitol [Internet]. 2019;207(107773):107773. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.exppara.2019.107773
25. Voytas D. Agarose gel electrophoresis. Curr Protoc Immunol [Internet]. 2001;Chapter 10(1):10.4.1-10.4.8. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1002/0471142735.im1004s02
26. Aronson N, Herwaldt BL, Libman M, Pearson R, Lopez-Velez R, Weina P, et al. Diagnosis and treatment of leishmaniasis: Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of America (IDSA) and the American society of tropical medicine and hygiene (ASTMH). Clin Infect Dis [Internet]. 2016;63(12):e202–64. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1093/cid/ciw670